增强整合素受体亲和力及靶细胞摄取能力的结构分子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种增强整合素受体亲和力及靶细胞摄取能力的结构分子，具有如式（I）所示的分子结构。它是由两个cRGD寡肽与6‑氨基己酸、谷氨酸寡肽或及精氨酸寡肽、8‑氨基‑3,6‑二氧杂辛酸或3‑马来酰亚胺基丙酸等物质反应，使氨基和羧基脱水缩合而得到。本发明专利技术的结构分子，能特异性结合表达αvβ3受体的肿瘤细胞及新生血管内皮细胞，通过受体介导内吞摄取所携带的核苷酸等分子进入细胞质内，提高αvβ3受体表达细胞的摄取效率及促进从靶细胞质内体中释放所携带分子，从而可以应用为制备靶向性治疗药物或疾病诊断示踪剂。

Structure, molecule and application of enhancing integrin receptor affinity and target cell uptake capability

The present invention discloses a structural molecule that enhances integrin receptor affinity and target cell uptake capability and has a molecular structure as shown in formula (I). It is composed of two cRGD and 6 oligopeptide aminocaproic acid, glutamic acid and arginine peptide or peptide and 8 amino 3,6 two oxa octanoic acid or 3 maleimide propionic acid and other substances, the condensation of amino and carboxyl groups by dehydration. The molecular structure of the invention, specific binding of alpha v beta 3 receptor expression in tumor cells and endothelial cells, nucleotide molecules through receptor-mediated endocytosis uptake carried in the cytoplasm, improve the alpha v beta 3 receptor expression of cellular uptake efficiency and promote the release of the molecules from the cytoplasm carry target in the body, which can be used for the preparation of targeted therapeutic drugs or disease diagnostic tracer.

【技术实现步骤摘要】
增强整合素受体亲和力及靶细胞摄取能力的结构分子及其应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种对靶细胞中的基因进行调控的技术。
技术介绍
小干扰RNA分子（siRNA)是RNA干扰（RNAi)理论的效应分子，可以特异性沉默引起或促进肿瘤增殖、侵袭和转移的基因，故siRNA分子作为一种新型的癌症治疗候选药物，具有极大的应用潜力。然而，siRNA分子的分子量大，且带负电荷，该特性与细胞膜的负电性和脂溶性的性质相互排斥，缺乏有效的递释系统，使其难以通过细胞膜直接进入细胞内，限制了siRNA分子进入靶细胞内部而阻碍了其临床应用。目前，常见临床前研究的siRNA分子递释系统包括病毒类和非病毒类系统。病毒类递释系统因其免疫原性及致瘤性而不适合临床应用；非病毒类递释系统如阳离子聚合物纳米粒、及纳米脂质体制剂存在制备工艺复杂、制备成本高、制剂不稳定、及体内应用毒性大等缺陷，直接制约了siRNA分子纳米粒给药系统的临床转化。具有临床转化价值的siRNA分子高效递释系统，应该具有能够容易制备、成本低、制剂稳定性好、毒副作用低、临床顺应性强、高效递释siRNA分子进入靶细胞内、易于从细胞内体中释放、及确保不妨碍siRNA分子的基因沉默活性等特点（LeeSH,KangYY,JangH,MokH.CurrentpreclinicalsmallinterferingRNA(siRNA)-basedconjugatesystemsforRNAtherapeutics[J].AdvancedDrugDeliveryReviews,2016,104:78-92.）。整合素αvβ3受体仅在新生血管内皮细胞及部分肿瘤细胞膜（如恶性胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、直肠癌和前列腺癌等）有高水平表达，该受体可与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列（简称RGD）结合（BarczykM,CarracedoS,GullbergD.Integrins[J].CellandTissueResearch,2010,339(1):269-280.），其中cyclo（-RGDfK）寡肽（简称cRGD）是其特异性配体之一，cRGD可将所携带的其它分子经αvβ3受体介导的内吞机制带入细胞内（HwangR,VarnerJ.Theroleofintegrinsintumorangiogenesis[J].HematolOncolClinNorthAm,2004,18(5):991-1006）。中国专利申请号为2013100198709的专利技术属于生物工程制药、蛋白质多肽类药物及生物医学工程领域，涉及对整合素受体αvβ3具有高亲和力的多肽及其应用，多肽序列为：Arg-Trp-Arg或Arg-Lys-Tyr。该专利技术的多肽比传统的RGD肽对于整合素αvβ3具有更强的亲和力，可用于癌症诊断和治疗中。中国专利申请号为2013100693674的专利技术公开了一种癌细胞靶向性结构分子及其应用，它是将摘要附图所示的分子与含有羧基结构和马来酐亚胺基团的连接分子反应，利用单个cRGD连接siRNA分子，使氨基和羧基脱水缩合，而得到癌细胞靶向性结构分子。这两个专利缺乏在靶向细胞体内发生作用的机理，对于siRNA等的摄取和释放能力未有能力或者能力太弱。
技术实现思路
本专利技术第一个目的：提供一种能够显著提高靶细胞中基因沉默效率的增强αvβ3受体亲和力及靶向细胞摄取能力的结构分子。第一技术方案：本专利技术的增强整合素受体（本文中特指整合素αvβ3，是一种跨膜的异质二聚体，它由两个非共价结合的跨膜亚基，即α和β亚基所组成）亲和力及靶向细胞摄取能力的结构分子具有如式（I）所示的分子结构。式（I），其中X基团的结构为或，其中n为1~10；Y基团的结构为或，其中m为1~10；Z基团为能够与两个X基团、一个Y基团同时链接的有机基团，优选具有如式（II）或者式（III）或者式（IV）所示的结构：式（II），式（III），式（IV）。其中1代表X基团的连接位置，2代表Y基团的连接位置。本专利技术所述的结构分子含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）三肽序列，能与特异性表达整合素αvβ3受体的细胞结合，呈现出较强的亲和力。本专利技术中，当n=1、m=1及Z的结构如式（II）所示时，所述的结构分子简写式为E-2Ahx-[cRGD]2-PEG-MPA，其中E为谷氨酸的简称，Ahx为6-氨基己酸的简称，cRGD为cyclo（-RGDfK）寡肽的简称，PEG为二氧杂辛酸的简称，MPA为3-马来酰亚胺基丙酸的简称；在所述的结构分子中它们均以基团的形式连接在一起。当n=1、m=1及Z的结构如式（III）式（IV）所示时，得到的结构分子简写式为E-2R-2Ahx-[cRGD]2-PEG-MPA，其中R为精氨酸的简称，在所述的结构分子中它以基团的形式连接在其中。这两种结构分子的结构式比较简单，合成路径简便，易于制备，成本较低，被靶向细胞摄取穿越细胞膜的能力更强。本专利技术的增强αvβ3受体靶向亲和力及摄取的结构分子的制备过程：由两个cyclo（-RGDfK）寡肽与6-氨基己酸（简称Ahx）、谷氨酸或及精氨酸寡肽（也可两种均有）、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸或者3-马来酰亚胺基丙酸等物质反应，使氨基和羧基脱水缩合得到，构建而成双价cRGD分子，即两个cRGD连接后形成的双价结构biRGD。在制备过程中，cyclo（-RGDfK）寡肽与6-氨基己酸（简称Ahx）、谷氨酸或精氨酸寡肽先进行反应，制备中间体；再将中间体与8-氨基-3,6-二氧杂辛酸或者3-马来酰亚胺基丙酸，在聚乙二醇溶剂（具有参与反应和溶解或分散剂的作用，减少团聚现象，增加亲和力和摄取能力）中进行化合反应为成品。分步完成，制成的成品纯度较高，副产物较少。如背景文献可知cRGD、biRGD的特点是可以经avb3受体介导内吞进入细胞浆内。由于siRNA分子的分子量大，且带负电荷，该特性与细胞膜的负电性和脂溶性的性质相互排斥，使其难以通过细胞膜直接进入细胞内。而本专利技术的结构分子能与带巯基（-SH）修饰的核苷酸分子连接，形成biRGD-siRNA分子、或者biRGD-寡核苷酸分子，等等。利用此特性，连接上siRNA分子、寡核苷酸分子或者其它化合物分子后，可将所携带的分子一并带入细胞内，促进siRNA分子、寡核苷酸分子或者其它化合物分子的靶细胞摄取，具有了较强的摄取能力。也即提高siRNA递释系统与整合素αvβ3受体的靶向亲和力，增强肿瘤部位靶向，提高肿瘤细胞及其附属的新生血管内皮细胞的摄取量。同时利用质子海绵效应，促进siRNA递释系统从内体中释放至细胞质中，实现细胞给药，甚至是细胞核内给药的目的。本专利技术的专利技术人研究发现biRGD，与αvβ3受体的细胞的亲和力更高，更容易使更多的被携带分子进入αvβ3受体表达的细胞内，可以减少给药剂量而且能够达到同等疗效的目的。当biRGD-siRNA整个结构通过αvβ3受体（细胞膜上的结构）介导进入靶细胞后，在细胞浆中形成一个新的复合结构：biRGD-siRNA。这也是三种基团Z结构的区别所在，即式（II）结构的作用仅是简单的起连接两个cRGD的作用；式（III）和式（IV）结构中不仅能连接两个cRGD，还多了“两个精氨酸”基团结构。精氨酸为含碱性的氨基酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增强整合素受体亲和力及靶细胞摄取能力的结构分子，其特征在于：具有如式（I）所示的分子结构：

【技术特征摘要】
1.一种增强整合素受体亲和力及靶细胞摄取能力的结构分子，其特征在于：具有如式（I）所示的分子结构：式（I），其中X基团为，或者，或者，其中n为1~10；Y基团为，或者，其中m为1~10；Z基团为能够与两个X基团、一个Y基团同时链接的有机基团。2.根据权利要求1所述的增强整合素受体亲和力及靶细胞摄取能力的结构分子，其特征在于：所述的Z基团具有下述结构：，或者，或者；其中1代表X基团的连接位置，2代表Y基团的连接位置。3.根据权利要求1或2所述的增强整合素受体亲和力及靶细胞摄取能力的结构分子，其特征在于：所述的n=1，m=1，所述的结构分子简写式为：E-2Ahx-[cRGD]2-PEG-MPA或者E-2R-2Ahx-[cRGD]2-PEG-MPA。4.根据权利要求1或2所述的增强整合素受体亲和力及靶细胞摄取能力的结构分子，其特征在于：其制备过程如下：由两个cRGD寡肽与6-氨基己酸、谷氨酸寡肽或及精氨酸寡肽、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸或者3-马来酰亚胺基丙酸反应，使氨基和羧基脱水缩合得到双价cRGD分子，即biRGD。5.根据权利要求4所述的增强整合素受体亲和力及靶向细胞摄取能力的结构分子，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：季爱民，岑柏宏，
申请(专利权)人：武汉泽智生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42