增强靶基因沉默效率的siRNA分子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种增强靶基因沉默效率的siRNA分子，其正义链除3’末端碱基外，所有核苷酸中的戊糖结构上的2’‑OH位均被2’‑氟或2’‑甲氧基取代；其反义链5’端碱基进行磷酸化修饰，起始后奇数位碱基用2’‑甲氧基修饰，偶数位碱基用2’‑氟修饰，且反义链3’端数起与靶基因互补的前3个碱基都用2’‑甲氧基修饰；该siRNA分子反义链3’可用磷酸酯键或硫代磷酸酯键连接1‑10个脱氧胸腺嘧啶，且确保含有2个硫代磷酸酯键修饰核苷酸骨架。本发明专利技术可用于沉默细胞因子VEGFR2、PIK3CB或EGFR的基因表达，组织靶向性分子修饰siRNA分子以提高转染效率，抑制内体质膜循环相关细胞因子功能，增加其基因沉默效率；同时这些siRNA分子单独或联合使用可用于治疗因基因突变或过表达引起的疾病。

SiRNA molecule and its application to enhance the silencing efficiency of target gene

The invention discloses a siRNA molecule to enhance the silencing efficiency of the target gene. Except for the 3 'terminal base, the 2 \u2011 Oh position of pentose structure in all nucleotides is replaced by 2 \u2011 fluorine or 2 \u2011 methoxy; the 5' terminal base of the antisense chain is phosphorylated, the odd base is modified with 2 \u2011 methoxy, the even base is modified with 2 \u2011 fluorine, and the antisense base is modified with 2 \u2011 methoxy The first three bases complementary to the target gene are all modified with 2 \u2011 methoxy at the 3 'end of the chain; the antisense 3' of the siRNA molecule can be connected with 1 \u2011 10 deoxythymines by phosphate or thiophosphate bonds, and the nucleotide skeleton can be modified with 2 thiophosphate bonds. The invention can be used for silencing the gene expression of VEGFR2, pik3cb or EGFR, modifying siRNA molecules with tissue targeted molecules to improve the transfection efficiency, inhibit the function of cytokines related to the internal plasma membrane circulation, and increase the gene silencing efficiency; at the same time, these siRNA molecules can be used alone or in combination to treat diseases caused by gene mutation or overexpression.

【技术实现步骤摘要】
增强靶基因沉默效率的siRNA分子及其应用
本专利技术涉及小干扰RNA分子的核苷酸序列及其增强基因沉默的技术。
技术介绍
小干扰RNA分子（SmallinterferingRNA,siRNA)是RNA干扰理论（2006年诺贝尔生理医学奖）的效应分子，能在细胞质或细胞核内特异性沉默引起疾病的过表达及突变基因，具有治疗疾病的应用前景(SullengerBA,etal.Science.2016;352(6292):1417-1420.)。siRNA分子是由两条单链RNA分子因序列全部互补或部分互补后形成的完全对称的双链结构或不对称双链结构，其中的一条链可与细胞内的靶RNA核苷酸序列部分或完全互补，称为指导链（guidestrand）或反义链(antisensestrand)。另一条链称为伴随链（passengerstrand）或正义链(sensestrand)；带负电荷，具有生物大分子结构特性。体内系统途径应用siRNA分子治疗疾病时存在稳定性差（易被核酸酶降解）、组织靶向性差、脱靶效应、易被肝肾清除、免疫原性、难以穿过细胞膜被靶细胞摄取、及难以从细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增强靶基因沉默效率的siRNA分子，所述的siRNA分子是由正义链和与其有15-19个互补碱基的反义链组成的双链核苷酸序列，核苷酸由磷酸、碱基、戊糖组成，碱基包括A、G、C、U、dA、dC、dG、dT；其特征在于：/n双链中，除正义链3’末端碱基外，所有核苷酸中的戊糖结构上的2’-OH位均被2’-氟或2’-甲氧基取代；/n所述的反义链是长度为18-29个碱基构成的核苷酸序列，其与细胞内靶RNA能够形成具有18-27个互补碱基对的互补序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种增强靶基因沉默效率的siRNA分子，所述的siRNA分子是由正义链和与其有15-19个互补碱基的反义链组成的双链核苷酸序列，核苷酸由磷酸、碱基、戊糖组成，碱基包括A、G、C、U、dA、dC、dG、dT；其特征在于：
双链中，除正义链3’末端碱基外，所有核苷酸中的戊糖结构上的2’-OH位均被2’-氟或2’-甲氧基取代；
所述的反义链是长度为18-29个碱基构成的核苷酸序列，其与细胞内靶RNA能够形成具有18-27个互补碱基对的互补序列。


2.如权利要求1所述的增强靶基因沉默效率的siRNA分子，其特征在于：正义链3’端起始的第1位碱基不修饰；随后第2位碱基开始的偶数位碱基用2’-甲氧基修饰，奇数位碱基用2’-氟修饰。


3.如权利要求1所述的增强靶基因沉默效率的siRNA分子，其特征在于：反义链5’端起始后奇数位碱基用2’-甲氧基修饰，偶数位碱基用2’-氟修饰；但从反义链3’端数起与靶基因互补的前3个碱基都用2’-甲氧基修饰，或反义链3’端部分不与正义链互补的单链中的每个碱基随机用2’-甲氧基或2’-氟修饰。


4.如权利要求1、2、3或4所述的增强靶基因沉默效率的siRNA分子，其特征在于：反义链5’端碱基进行磷酸化或硫代磷酸化修饰，且该位置数起第一位与第二位的碱基用硫代磷酸酯键连接，反义链3’端起始后至少含有2个硫代磷酸酯键修饰核苷酸骨架；用于沉默靶基因PD-1的基因表达，其正义链及反义链的序列分别选自如表2中的品种。


5.如权利要求4所述的增强靶基因沉默效率的siRNA分子，其特征在于：所述反义链3’端可连接0-10个dT，且与正义链非互补片段中的碱基间通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键连接；用于沉默靶基因PD-1的基因表达，其正义链及反义链的序列分别选自如表3中的品种。


6.如权利要求1、2或3所述的增强靶基因沉默效率的siRNA分子，其特征在于：用于沉默细胞因子VEGFR2、PIK3CB及EGFR的基因表达，其正义链及反义链的序列选自如表1中的下列品种；或者，其正义链与表1所述siRNA分子中正义链序列有75%以上同源性，或反义链与表1所述siRNA分子中反义链序列有75%以上的同源性；
所述siRNA分子序列为：
siHVR2-5：正义链：CUGUAAGUACCCUUGUUAUdTdT，
反义链：AUAACAAGGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：季爱民，岑柏宏，黄文，黎权辉，
申请(专利权)人：武汉泽智生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42