纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用制造技术

本发明专利技术提出了纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用，属于基因工程及其应用领域，能够解决纳米化RNAi制剂在防治PVY病毒方面的问题。该RNAi制剂是由dsRNA和壳聚糖纳米材料制成的，其中dsRNA是由三个基因衣壳蛋白CP、辅助成分‑蛋白酶HC‑Pro和基因组连接蛋白VPg制得的，它们对PVY病毒在植物体内复制增殖移动起到关键作用的基因。本发明专利技术提供的纳米化RNAi制剂用于PVY的病毒防治，可使dsRNA的稳定性更强、作用更加持久，能起到良好的病毒防治效果，本发明专利技术在PVY病毒防治领域具有良好的应用前景。

Application of nano RNAi preparation in PVY control

The invention proposes the application of nano RNAi preparation in PVY prevention and control, belonging to the field of genetic engineering and application, and can solve the problem of nano RNAi preparation in PVY virus prevention and control. The RNAi preparation is made of dsRNA and chitosan nano materials, among which dsRNA is made of three gene capsid protein CP, auxiliary component \u2011 protease HC \u2011 pro and genome connecting protein VPG, which play a key role in the replication, proliferation and movement of PVY virus in plants. The nano RNAi preparation provided by the invention is used for virus prevention and control of PVY, which can make the stability of dsRNA stronger, function more lasting, and play a good virus prevention and control effect. The invention has a good application prospect in the field of PVY virus prevention and control.

【技术实现步骤摘要】
纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种纳米化RNAi制剂在PVY防治中的新应用。
技术介绍
马铃薯Y病毒(PotatoVirus，PVY)的宿主广泛，是全世界范围内的一种病毒，可引起植物叶脉坏死，造成重大的经济损失，但该病毒至今仍缺少有效的防治措施。近年来，已有研究报道了通过纳米材料与dsRNA结合的方式，解决dsRNA存在的自身稳定性差、易降解等问题，达到对某些植物病毒的良好防治效果。如中国专利文献CN109169702A公开了一种纳米化的RNAi制剂在TMV病毒防治方面的应用，该现有技术具有环境友好、持效时间长、对作物无害等多重优点，能有效防治TMV病毒。尽管纳米化的RNAi制剂在TMV病毒防治方面取得良好效果，但对于该制剂在PVY病毒防治的应用研究鲜少，所以能有效利用现有技术的思路，将该制剂运用到PVY的病毒防治中，对于该病毒的大规模防治具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用，该制剂具有稳定性强、不易被降解、促进dsRNA在植物体内穿梭和转运来增加药效等优点，能有效防治PVY。为了达到上述目的，本专利技术采用的具体技术方案为：本专利技术提供了纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用，所述纳米化RNAi制剂是由dsRNA和壳聚糖纳米材料制成的，所述dsRNA是包括衣壳蛋白CP、辅助成分-蛋白酶HC-Pro和基因组连接蛋白VPg的三个对PVY在植物体内复制增殖移动起到关键作用的蛋白基因制得。作为优选，所述dsRNA的制备方法，包括以下步骤：选取经PVY侵染后的植物叶片，提取其总RNA后，通过逆转录过程得到PVY的cDNA；以所述PVY的cDNA为模板，设计CP、HC-Pro和VPg序列的扩增引物，进行PCR扩增，得到所述三种基因的扩增产物；以所述扩增产物为模板，体外合成dsRNA。作为优选，所述dsRNA的浓度为0.8～1.5μg/μl。作为优选，步骤所述的提取总RNA的方法为Trizol抽提法或根据总RNA提取试剂盒的说明书提取得到。作为优选，步骤所述CP基因的上下游引物序列为SEQIDNO.1-2所示的DNA序列，HC-Pro基因的上下游引物序列为SEQIDNO.3-4所示的DNA序列，VPg基因的上下游引物引物序列为SEQIDNO.5-6所示的DNA序列。作为优选，所述壳聚糖纳米材料的制备方法是将壳聚糖溶解于1％冰乙酸中，制得壳聚糖纳米材料；所述壳聚糖纳米材料溶液的终浓度为1.5～2.5μg/μl。作为优选，所述纳米化RNAi制剂是将dsRNA液体缓慢加到所述壳聚糖纳米材料溶液中混匀后制得。作为优选，所述壳聚糖和dsRNA的质量比是(10～30):1。作为优选，所述纳米化RNAi制剂的使用方法是将成品溶液均匀涂抹或喷施在植物叶片上。作为优选，所述纳米化RNAi制剂可施用于烟草、番茄、辣椒或马铃薯叶片。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：(1)本专利技术提供了纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用，以PVY的三种基因衣壳蛋白CP、辅助成分-蛋白酶HC-Pro和基因组连接蛋白VPg为模板体外合成相应的dsRNA，通过与壳聚糖纳米材料的结合提高dsRNA的稳定性，使其能更稳定的引起植物体内的RNAi；(2)本专利技术提供的制剂除了能增加dsRNA的稳定性，还能促进dsRNA在植物体内的转运和穿梭，达到增加药效的目的；(3)本专利技术提供的制剂dsRNA浓度为0.8～1.5μg/μl，壳聚糖纳米材料溶液浓度为1.5～2.5μg/μl，且当壳聚糖纳米材料溶液与dsRNA的混合比例为(10～30:1)时两者混合后的效果良好；(4)本专利技术提供的纳米化RNAi制剂可采用喷洒或施肥的方式，应用于PVY的防治；(5)本专利技术提供的纳米化RNAi制剂可作为生物助长器，应用于农业方面的相关生产中。附图说明图1为本专利技术实施例1所提供的提取PVYRNA的琼脂糖凝胶电泳结果图，图中：从左到右的泳道分别为Marker、PVYRNA1、PVYRNA2、PVYRNA3；图2为本专利技术实施例1所提供的体外转录合成dsRNA的琼脂糖凝胶电泳结果图，图中：从左到右的泳道分别为Marker、对照组、CPdsRNA、HC-ProdsRNA和VPgdsRNA；图3为本专利技术实施例1所提供的dsRNA与不同比例壳聚糖融合的琼脂糖凝胶电泳图，图中：从左到右的泳道分别为Marker，CPdsRNA：壳聚糖1:2，1:5，1:10，1:20，1:30；Marker，HC-ProdsRNA:壳聚糖1:2，1:5，1:10，1:20，1:30；Marker，VPgdsRNA:壳聚糖1:2，1:5，1:10，1:20，1:30。图4为本专利技术实施例2所提供的经PVY和dsRNA-壳聚糖接种后烟草叶片的表型结果，图中4-1、4-2、4-3、4-4、4-5分别为CPdsRNA+PVY烟草感病情况、HC-ProdsRNA+PVY烟草感病情况、VPgdsRNA+PVY烟草感病情况、PVY烟草染病情况和阴性对照组感病情况。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例提供了纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用，所述纳米化RNAi制剂是由dsRNA和壳聚糖纳米材料制成的，所述dsRNA是包括衣壳蛋白CP、辅助成分-蛋白酶HC-Pro和基因组连接蛋白VPg的三个对PVY在植物体内复制增殖移动起到关键作用的蛋白基因制得。dsRNA是由三个基因蛋白CP、辅助成分-蛋白酶HC-Pro和基因组连接蛋白VPg制得的，选取这三个基因的原因在于CP基因作为病毒的衣壳蛋白，包裹病毒的基因组单链RNA，同时也在细胞间的复制增殖移动，蚜虫传播和基因组扩增等方面产生重要影响；HC-Pro在基因组的扩增，自身互作，细胞间的长距离运输，病毒的种传等方面起到重要作用；VPg基因也在长距离运输和基因组扩增过程中担任重要的角色，所以三个基因在病毒的复制增殖移动方面均起到十分重要的作用，通过RNAi技术特异性的沉默三个重要的功能基因，对于PVY病毒的防治意义重大。在一优选实施例中，所述dsRNA的制备方法，包括以下步骤：S1：选取经PVY侵染后的植物叶片，提取其总RNA后，通过逆转录过程得到PVY的cDNA；S2：以所述PVY的cDNA为模板，设计HC-Pro、CP和VPg序列的扩增引物，进行PCR扩增，得到所述三种基因的扩增产物；S3：以所述扩增产物为模板，进行dsRNA体外合成。在一优选实施例中，所述dsRNA的浓度为0.8～1.5μg/μl。...

【技术保护点】
1.纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用，其特征在于，所述纳米化RNAi制剂是由dsRNA和壳聚糖纳米材料制成的，所述dsRNA是包括衣壳蛋白CP、辅助成分-蛋白酶HC-Pro和基因组连接蛋白VPg的三个对PVY在植物体内复制增殖移动起到关键作用的蛋白基因制得。/n

【技术特征摘要】
1.纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用，其特征在于，所述纳米化RNAi制剂是由dsRNA和壳聚糖纳米材料制成的，所述dsRNA是包括衣壳蛋白CP、辅助成分-蛋白酶HC-Pro和基因组连接蛋白VPg的三个对PVY在植物体内复制增殖移动起到关键作用的蛋白基因制得。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述dsRNA的制备方法，包括以下步骤：
选取经PVY侵染后的植物叶片，提取其总RNA后，通过逆转录过程得到PVY的cDNA；
以所述PVY的cDNA为模板，设计CP、HC-Pro和VPg序列的扩增引物，进行PCR扩增，得到所述三种基因的扩增产物；
以所述扩增产物为模板，体外合成dsRNA。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述dsRNA的浓度为0.8～1.5μg/μl。


4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述提取总RNA的方法为Trizol抽提法或根据总RNA提取试剂盒的说明书提取得到。


5.根据权利要求2所述的应用，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨金广，许曼琳，刘明宏，王小彦，迟玉成，张霞，王凤龙，李莹，王杰，申莉莉，于静，郭志青，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，山东省花生研究所，贵州省烟草公司遵义市公司，
类型：发明
国别省市：山东;37