本发明专利技术涉及细叶百合(Lilium pumilum DC.)耐盐基因LpNAC20的克隆及其应用。包括以下步骤：(1)目的基因的克隆；(2)表达载体的构建；(3)转基因植株生理指标的检测。本项实验以细叶百合为研究对象，应用RT‑PCR技术克隆LpNAC20基因；通过构建过表达载体转化烟草；通过转基因烟草鉴定LpNAC20的过表达提高烟草盐胁迫的功能，揭示细叶百合NAC基因在受到逆境胁迫时有何功能，为细叶百合在百合育种的进一步应用奠定基础，为NAC转录因子的功能和作用提供理论依据。
Cloning and application of salt tolerant gene lpnac20 from Lilium pumila
The invention relates to the cloning and application of the salt tolerant gene lpnac20 of Lilium pumilum DC. It includes the following steps: (1) cloning of target gene; (2) construction of expression vector; (3) detection of physiological indexes of transgenic plants. In this experiment, lpnac20 gene was cloned by RT \u2011 PCR, transformed into tobacco by constructing over expression vector, identified by transgenic tobacco to improve the function of tobacco salt stress, revealed the function of NAC gene in Lilium under stress, laid the foundation for further application of Lilium in Lilium breeding and NAC transcription The function and function of factors provide theoretical basis.
【技术实现步骤摘要】
细叶百合耐盐基因LpNAC20的克隆及其应用
本专利技术涉及基因
，尤其涉及一种细叶百合耐盐基因LpNAC20及其应用。特别涉及一种细叶百合LpNAC20基因的克隆、表达载体的构建、烟草的转化，以及所述基因在提高转基因植物盐胁迫抗性的应用。
技术介绍
NAC转录因子是植物中一类非常重要的转录因子，参与植物生长发育、生物与非生物胁迫、激素信号传导通路和光信号通路等多种反应。不少研究已经证实NAC转录因子在植物发育和生长调节以及逆境应答分子网络中扮演着极其重要的角色，目前已发现多个NAC蛋白参与植物对逆境的响应。细叶百合(LiliumpumilumDC.)又名山丹，为百合科百合属多年生草本植物。细叶百合在食用、药用、观赏方面都有一定的应用价值，在园林应用方面其观赏价值尤为突出。同时细叶百合抗盐性很强，是优良的百合属种质资源，可用于培育抗盐的百合新品种。本项实验以细叶百合为研究对象，应用RT-PCR技术克隆LpNAC20基因；通过构建过表达载体转化烟草；通过转基因烟草鉴定LpNAC20的过表达植株抵抗盐胁迫的功能，为细叶百合在百合育种的进一步应用奠定基础，为NAC转录因子的功能和作用提供理论依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种细叶百合耐盐基因，并验证其功能。为了实现上述任务，本专利技术采取如下技术解决方案：一种细叶百合耐盐基因，其特征在于，该细叶百合耐盐基因含ORF开放阅读框的部分核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，长度为1986bp；其cDNA编码氨基酸序列为SEQIDNO.1所示，编码661个氨基酸。与现有技术相比，本专利技术的细叶百合耐盐基因，带来的有一技术效果在于：1、得到了细叶百合耐盐基因含ORF开放阅读框的部分核苷酸序列。2、根据申请人的实验证明，将该细叶百合LpNAC20基因转入烟草中，能够明显提高烟草的耐盐能力，可用于提高转基因植物的盐胁迫抗性。培育得到抗盐能力强的烟草品种，通过以下步骤得以实现：1)将细叶百合耐盐基因和植物表达载体pBI121-GFP用T4连接酶连接，构建过表达载体；2)将构建的过表达载体质粒导入农杆菌EHA105，利用农杆菌介导法将LpNAC20基因转入烟草植株，利用卡那霉素筛选阳性植株，采集阳性植株叶片提取DNA和RNA进行分子水平鉴定；3)将所筛选得到的烟草株系的种子和野生型烟草种子后接种于1/2MS培养基中，通过炼苗，移栽入土中，选取大小基本一致的烟草植株，进行300mmol/L的NaCl盐胁迫处理，观察植物的生长状态，15d后拍照并剪取相同部位的健康叶片并测定其生理指标。附图说明图1细叶百合鳞茎RNA提取电泳结果图；图2细叶百合LpNAC20基因编码区序列验证电泳图；A：PCR结果；B：转入大肠杆菌后菌液PCR；图3细叶百合LpNAC20基因中间载体验证电泳图；A:连接pMD18-T中间载体；B:中间载体pMD18-T双酶切；图4细叶百合LpNAC20基因植物表达载体验证电泳图；A：植物表达载体鉴定；B：表达载体酶切鉴定；图5细叶百合LpNAC20基因转农杆后菌液PCR鉴定；图6转基因烟草植株鉴定结果；A：转基因烟草T0代植株DNA的PCR鉴定B：转基因烟草T0代植株cDNA的PCR鉴定；图7为转基因烟草在盐胁迫处理后生理指标检测结果：其中，A为盐胁迫后叶绿素含量的检测结果，B为盐胁迫处理后脯氨酸含量的检测结果，C为盐胁迫处理后可溶性蛋白含量的检测结果；图8为转基因烟草在盐胁迫处理后生理指标检测结果：其中，A为盐胁迫处理后超氧化物歧化酶(SOD)活性的检测结果，B为盐胁迫处理后过氧化物酶(POD)活性的检测结果，C为盐胁迫处理后过氧化氢酶(CAT)活性的检测结果；下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。具体实施方式实施例1细叶百合鳞茎RNA提取和cDNA的合成用CTAB法提取细叶百合鳞茎总RNA，用适量RNAse水溶解RNA。取1μlRNA溶液用DEPC水稀释100倍，以DEPC水为空白对照调零，用紫外分光光度计测定A260/A280比值，测定RNA的浓度与纯度；将提取的RNA用1％的琼脂糖凝胶，检测其完整性，电泳结果如图1所示，将提取的RNA保存于-80℃冰箱中备用。取-80℃保存的RNA，检测RNA浓度均在1100ng/ul左右，按照反转录试剂盒ReverTraAceqPCRRTKit(TOYOBO)说明书进行，总反应体系为50ul，其中：反转录程序为：37℃15min；98℃5min。反应结束后立即放冰上冷却，保存于-20℃冰箱中备用。实施例2细叶百合LpNAC20基因编码区序列的克隆根据细叶百合基因的编码区序列，用PrimerPremier5设计特异性引物：LpNAC20F：GTTCCTCCTATGGCTCTCAGLpNAC20R：TATACACACCACGGGTACAA；进行编码区序列的克隆：以细叶百合cDNA为模板进行PCR扩增反应，反应体系为：总反应体系50μl，其中：PCR扩增程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30sec，65-55℃退火30sec，68℃延伸1min，循环35次，72℃最终延伸10min，4℃forever；经过胶回收连接到克隆载体pMD18-T载体(TaKaRa)上，进一步通过菌液PCR检测(图2)，选取条带明亮且清晰的菌液送公司进行测序，提取测序比对结果正确的菌液的质粒，保存与-20℃冰箱中。将获得的细叶百合NAC基因的全长cDNA序列，利用NCBI网站上的BLASTp功能对NAC基因进行保守结构域分析，利用ExPASy网站的Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)生物信息学工具分析NAC蛋白序列的氨基酸数目、理论等电点和疏水性等基本信息。利用PlantTFDB(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)数据库进一步预测NAC转录因子的功能。利用NCBI上的BLASTp功能将NAC基因编码的氨基酸序列进行比对，得到与该氨基酸序列具有同源性的其他植物中的NAC转录因子氨基酸序列，选取相似度较高的序列使用DNAMAN软件进行序列比对并构建系统进化树。实施例3细叶百合LpNAC20基因的植物表达载体的构建中间表达载体的构建：1)根据细叶百合LpNAC20基因序列针对PBI121-GFP表达载体图谱分析合适的酶切位点，利用Primer5设计合适的加酶切位点引物：LpNAC20-KpnI：GGTACCATGAACGGCGCATCCTCCTCLpNAC20-SpeI：ACTAGTCCTGCTACAGATCCGAATCC；2)以测序正确的全长cDNA质粒稀释100倍为模板，以加酶切位点的引物进行P本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细叶百合耐盐基因LpNAC20其特征在于，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种细叶百合耐盐基因LpNAC20其特征在于，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1所述的细叶百合耐盐基因用于培养提高转基因植物的盐胁迫抗性的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，按以下步骤进行：
1)将细叶百合耐盐基因和植物表达载体pBI121-GFP用双酶切后再用T4连接酶连接，构建烟草过表达载体；
2)将烟草过表达载体质粒用电转化法导入农杆菌EHA105中，利用农杆菌介导法侵染烟草叶片，利用卡...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔颖，张彦妮，曹尚杰，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙;23
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