一种铁皮石斛种胚微粒的克隆培养技术制造技术

本发明专利技术公开一种铁皮石斛种胚微粒的克隆培养技术，主要应用于具有药用、食用价值的高品质铁皮石斛原球茎的大规模生产。本发明专利技术选用铁皮石斛的成熟果荚，经无菌消毒后取出种胚微料接入克隆液体培养基，通气低温暗培养一周后，转入光照27℃下继续通气悬浮培养三周，至种胚微粒完成萌发、膨胀、转绿，形成锥形小原球茎，此可作为铁皮石斛药用原球茎大规模生产的种质材料。本发明专利技术采用铁皮石斛原球茎专用通气悬浮培养装置进行克隆培养，可以为培养过程不断地提供新鲜溶氧、有效的搅拌和实时补料，促进种胚快速生长，整个培养周期仅为一个月，与传统培养技术需3-4个月相比，大大缩短了生产周期，且单批次生产规模大、产量高、成本低，由于是应用克隆技术，可以有效保障植物体的遗传稳定性和安全性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物细胞工程领域，具体涉及的是一种铁皮石斛种胚微粒的克隆培养技术。
技术介绍
铁皮石斛（Dendrobium officinale Kmuraet Migo）是我国传统名贵中药材，味甘，性微寒，具有生津养胃、滋阴清热、润肺益肾、明目强腰等功效。根据国家药典记载，其主要药效成份为石斛多糖和石斛碱。铁皮石斛药用原球茎是由铁皮石斛果荚中的种胚微粒经液体克隆形成球茎原胚体，该阶段，可通过营养调节和特殊的培养条诱导使原球茎富集了大量的初生和次生代谢产物，其中石斛碱、毛兰素和多糖的含量均为其整个生长过程中最高的阶段。经临床研究证明此类原球茎具有与市售铁皮石斛鲜条和枫斗同等的药用和保健价值。种胚微粒是指铁皮石斛成熟果荚中粉状、细小的淡黄色微粒，每一颗种胚微料都携带了植物母本全部遗传基因，在野外环境下，其需与某真菌诱导子结合才能萌发，故自然萌发率极低，在实验室环境下，可通过克隆诱导的方式可直接形成铁皮石斛原球茎和铁皮石斛植株。目前，原球茎的传统生产方式是利用对铁皮石斛外植体芽茎段的诱导产生小细胞团，再对小细胞团进行扩繁和不断继代培养而获得的，严格意义来说，此类原球茎应称为类原球茎团，由于是从外植的细胞诱导，且不断地继代培养而使得其遗传特性具有随机性和较大突变机率，不能完全保留母本的全部遗传性状，从而导致其表达谱不能与母本完全一致，主要活性成份如多糖、石斛碱等表达量低或表达产物发生改变，使类原球茎团在药用或食用价值和安全性上都得不到保证。有鉴于此，本专利技术人针对上述缺陷深入研究，遂有本案产生。本专利技术中的原球茎均为单一种胚微粒诱导形成，原球茎在增殖的过程中不形成多个不规则细胞团，而是生长发育成较大的植株胚状体，具有植物体特征。每一颗种胚微粒在诱导形成药用原球茎的过程中只进行自体生长发育，而不会分化成多个异体细胞团，从而完整地保留了母本的遗传特性。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种铁皮石斛种胚微粒的克隆培养技术，主要应用于具有药用、食用价值的高品质铁皮石斛原球茎的大规模生产。本专利技术专利选用铁皮石斛的成熟果荚，经无菌消毒后取出种胚微料接入克隆液体培养基，通气低温暗培养一周后，转入光照27℃下继续通气悬浮培养三周，至种胚微粒完成萌发、膨胀、转绿，形成锥形小原球茎，此可作为铁皮石斛药用原球茎大规模生产的种质材料。本专利技术采用铁皮石斛原球茎专用通气悬浮培养装置进行克隆培养，可以为培养过程不断地提供新鲜溶氧、有效的搅拌和实时补料，促进种胚快速生长，整个培养周期仅为一个月，与传统培养技术需3-4个月相比，大大缩短了生产周期，且单批次生产规模大、产量高、成本低，由于是应用克隆技术，可以有效保障植物体的遗传稳定性和安全性。为了达成上述目的，本专利技术的解决方案是：一种铁皮石斛种胚微粒的克隆培养技术，该技术选用人工种植的铁皮石斛成熟果荚，果荚饱满，青绿或绿紫色，采收于十月至十一月期间，先用干燥纸巾包裹好，放入存有干燥剂的带盖玻璃瓶，低温4℃下处理3天后，取出用手术刀片将果荚的多余部份切除，只留1～2cm长的果柄，称重并记录。进一步，将处理好的果荚移入已经灭过菌的超净工作台内，先用酒精棉球擦拭果荚表面，于10%次氯酸钠处理10min，无菌水冲洗3次，然后浸入70%酒精中40s，无菌水冲洗3次，置于接种盘中切开果荚底部，均匀地播入装有克隆液体培养基的通气培养瓶中，播完种的果荚取出，称重并记录，计算播入种胚微粒的克数。进一步，将播完种的通气培养瓶先套入避光袋中，放置培养架上，连接通气泵，通气量5L/min, 溶氧系数2%，培养温度20℃，进行暗培养1周，再移去避光袋，进光照培养，通气量10L/min，溶氧系数2%，培养温度27℃，光照强度2500Lux，培养4周，期间每隔一周进行一次补液，共3次。本专利技术中的克隆液体培养的配方为：改良MS培养基，其中硝酸铵更换成硫酸铵，加入量减半，氯化钙加入量减半；植物生长调节剂：6苄基腺嘌呤0.02份量；渗透调节剂、碳源：蔗糖40份量；氨基酸补充剂、氮源：酸水解酪蛋白0.2份量，天然有机添加物：马铃薯汁150份量，加超纯水配制成1000份量。补料配方为：1/4改良MS培养基，单次补液量为培养基总量的1/3，共补液3次。与现有技术比较，本专利技术采用铁皮石斛原球茎专用通气悬浮培养装置进行克隆培养，可以为培养过程不断地提供新鲜溶氧、有效的搅拌和实时补料，促进种胚快速生长，整个培养周期仅为35天，与传统培养技术需3-4个月相比，大大缩短了生产周期，且单批次生产规模大、产量高、成本低，由于是应用克隆技术，可以有效保障植物体的遗传稳定性和安全性。本专利技术所生产获得的小原球茎可作为铁皮石斛药用原球茎大规模生产的最佳种质材料，这为实现铁皮石斛药用原球茎的工厂化生产提供技术和原料支撑，可以快速推进铁皮石斛产业化的发展进程，用科技来保障产品安全和效用，以及通过有效的降低生产成本和零售成本，来让更多人能够消费得起曾经只供皇室独享的民间仙草——铁皮石斛。具体实施方式为了进一步解释本专利技术的技术方案，下面结合本专利技术实施例和现有固体培养实施例、液体振荡培养实施来对本专利技术进行详细阐述。实施例一：本案专利技术选用人工种植的铁皮石斛成熟果荚，果荚饱满，青绿或绿紫色，采收于10月15日，先用干燥纸巾包裹好，放入存有干燥剂的带盖玻璃瓶，低温4℃下处理3天后，用手术刀片将果荚的多余部份切除，只留1.5cm长的果柄，称重并记录，得1.63g。将处理好的果荚移入已经灭过菌的超净工作台内，先用酒精棉球擦拭果荚表面，于10%次氯酸钠处理10~20min，无菌水冲洗3次，然后浸入70%酒精中40smin，无菌水冲洗3次，置于接种盘中切开果荚底部，均匀地播入装有克隆液体培养基的通气培养瓶中，播完种的果荚取出，称重并记录，得0.93g，计算播入种胚微粒的克数为0.7g。将播完种的通气培养瓶先套入避光袋中，放置培养架上，连接通气泵，通气量5L/min, 溶氧系数2%，培养温度20℃，进行暗培养1周，再移去避光袋，进光照培养，通气量10L/min，溶氧系数2%，培养温度25℃，光照强度2500Lux，培养4周，期间每隔一周进行一次补液，共3次。培养结束后取出小原球茎，外观记录为：黄绿色，形态饱满，锥形球状，球茎较大；沥干水份后，称重得81.23g，计算增殖倍数为115.7。本实施例的克隆液体培养的配方为：改良MS培养基，其中硝酸铵更换成硫酸铵，加入量减半，氯化钙加入量减半；植物生长调节剂：6苄基腺嘌呤0.2mL；渗透调节剂、碳源：蔗糖40g；氨基酸补充剂、氮源：酸水解酪蛋白0.2g，天然有机添加物：马铃薯汁150g，加超纯水定容至1L。补料配方为：1/4改良MS培养基，单次补液量为培养基总量的350mL，共补液三次。实施例二：固体培养选用人工种植的铁皮石斛成熟果荚，果荚饱满，青绿或绿紫色，采收于10月15日，先用干燥纸巾包裹好，放入存有干燥剂的带盖玻璃瓶，低温4℃下处理3天后，用手术刀片将果荚的多余部份切除，只留1.5cm长的果柄，称重并记录，得1.45g。将处理好的果荚移入已经灭过菌的超净工作台内，先用酒精棉球擦拭果荚表面，于10%次氯酸钠处理10~20min，无菌水冲洗3次，然后浸入70%酒精中40smin，无菌水冲洗3次，置于接种盘中切开果荚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铁皮石斛种胚微粒的克隆培养技术，其特征在于，包括以下内容：①选用铁皮石斛成熟果荚中的种胚微粒作为接种材料；②将铁皮石斛种胚微粒接入克隆液体培养基中通气悬浮培养；③完成接种后先通气暗培养一周后转入光照27℃下继续通气悬浮培养三周；④从培养时间开始到培养结束过程中每隔一周进行一次补料操作；⑤培养至种胚微粒完全萌发、膨胀、转绿，形成锥形小球茎。

【技术特征摘要】
1.一种铁皮石斛种胚微粒的克隆培养技术，其特征在于，包括以下内容：①选用铁皮石斛成熟果荚中的种胚微粒作为接种材料；②将铁皮石斛种胚微粒接入克隆液体培养基中通气悬浮培养；③完成接种后先通气暗培养一周后转入光照27℃下继续通气悬浮培养三周；④从培养时间开始到培养结束过程中每隔一周进行一次补料操作；⑤培养至种胚微粒完全萌发、膨胀、转绿，形成锥形小球茎。2.如权利要求1所述的一种铁皮石斛种胚微粒的克隆培养技术，其特征在于，所述内容①中先用酒精棉球擦拭果荚表面，于5~10%次氯酸钠处理10~20min，无菌水冲洗3~5次，然后浸入70~75%酒精中30s~1min，无菌水冲洗3~5次，置于接种盘中切开果荚底部，均匀地播入装有克隆液体培养基的通气培养瓶中。3.如权利要求1所述的一种铁皮石斛种胚微粒的克隆培养技术，其特征在于，所述内容②中的克隆液体培养的配方为：改良MS培养基，其中硝酸铵更换成硫酸铵，加入量减半，氯化钙加入量减半；植物生长调节剂：6苄基腺嘌呤...

【专利技术属性】
技术研发人员：林潘海，
申请(专利权)人：泉州正和堂生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35