一种斜带石斑鱼IRF10基因启动子和制备方法技术

本发明专利技术公开了一种斜带石斑鱼IRF10基因启动子和制备方法。所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：a、Seq ID No.1所示的核苷酸序列；b、与Seq ID No.1互补的核苷酸序列；c、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。所述启动子可在构建斜带石斑鱼IRF10基因的表达调控机理实验系统中应用。

A promoter and preparation method of irf10 gene in grouper Epinephelus obliquus

The invention discloses an irf10 gene promoter and a preparation method of the grouper. The promoter comprises a nucleotide sequence selected from any of the following groups and having promoter function: A, the nucleotide sequence shown in SEQ ID No.1; B, the nucleotide sequence complementary to SEQ ID No.1; C, the nucleotide sequence capable of hybridizing with the nucleotide sequence of a or B under high tight conditions; D, substituting one or more bases for the nucleotide sequence shown in a or B Deletion and addition of modified nucleotide sequence; e. nucleotide sequence with at least 90% identity with the nucleotide sequence shown in a or B above. The promoter can be used in the construction of the experimental system for the expression and regulation mechanism of irf10 gene of grouper.

【技术实现步骤摘要】
一种斜带石斑鱼IRF10基因启动子和制备方法
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种斜带石斑鱼IRF10基因启动子和制备方法。
技术介绍
干扰素调节因子(Interferonregulatoryfactors，IRFs)是一类多功能的转录因子，可调控干扰素(Interferon，IFN)以及干扰素刺激应答基因(Interferon-stimulatedgene，ISG)的表达，在机体抗病毒、抗肿瘤、细胞增殖和凋亡等方面发挥着重要的作用(HiscottJ.,ConvergenceoftheNF-κBandIRFpathwaysintheregulationoftheinnateantiviralresponse.Cytokine&GrowthFactorReviews2007,18(5-6):483-490.)。已有的报道表明，在硬骨鱼类中已经发现11个IRF家族成员，即IRF1-11。根据系统进化分析结果可将IRF分为4个亚家族：IRF1亚家族(IRF1、IRF2、IRF11)，IRF3亚家族(IRF3和IRF7)，IRF4亚家族(IRF4、IRF8、IRF9、IRF10)，还有IRF5亚家族(IRF5和IRF6)(HuangB,QiZT,XuZ,etal.,Globalcharacterizationofinterferonregulatoryfactor(IRF)genesinvertebrates:Glimpseofthediversificationinevolution.BMCImmunology2010,11(1):22.)。真核生物基因转录过程受多层次的精确调控，启动子及其所包含的顺式作用元件直接影响基因的转录表达。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有启动子功能的斜带石斑鱼IRF10基因。为实现上述目的，本专利技术提供一种斜带石斑鱼IRF10基因启动子，其特征在于，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：a、SeqIDNo.1所示的核苷酸序列；b、与SeqIDNo.1互补的核苷酸序列；c、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。本专利技术还提供一种核酸构建体，包含所述的启动子，与启动子可操作连接的基因序列，其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。本专利技术还提供一种载体，其特征在于：所述载体含有所述的启动子或所述的核酸构建体；优选的，所述载体为所述的启动子或所述的核酸构建体与pGL3-Basic质粒经重组得到的重组载体。本专利技术还提供一种重组细胞，其特征在于：所述细胞含有所述的启动子或所述的核酸构建体或所述的载体，优选的，所述重组细胞为EPC细胞。本专利技术还提供一组引物对，所述引物对用于扩增得到所述的启动子，其特征在于：所述引物对的序列为SEQIDNO:2-5的序列所示。进一步，包括以斜带石斑鱼基因组DNA为模板，使用三对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQIDNO：1在斜带石斑鱼基因组DNA的序列分别针对首尾进行设计，优选是所述的引物对。本专利技术还保护所述的启动子或所述的核酸构建体或者所述的载体或所述的重组细胞用于调控荧光素酶的用途。本专利技术采用染色体步移技术克隆了斜带石斑鱼IRF10基因启动子，提供了斜带石斑鱼IRF10基因启动子序列；经报告基因分析实验证明了该斜带石斑鱼IRF10基因启动子可被细胞内及细胞外polyI:C诱导激活；经定点突变技术和报告基因分析鉴定了三个斜带石斑鱼IRF10基因转录调控核心元件；因此，该斜带石斑鱼IRF10基因启动子的克隆及其核心调控元件的鉴定，在理论上将为研究斜带石斑鱼IRF10基因表达的分子调控机理提供良好的实验系统，在应用上为利用该启动子构建真核表达载体高效表达外源基因或将该启动子应用于转基因鱼构建创造了条件，具有重要的理论和实际意义。所述斜带石斑鱼IRF10基因启动子的克隆及其启动子核心调控元件的鉴定，可在构建斜带石斑鱼IRF10基因的表达调控机理实验系统中应用。附图说明图1为本专利技术所述SEQIDNO:1序列上三个转录因子结合位点的位置示意图。图2为本专利技术所述斜带石斑鱼IRF10基因启动子核心调控元件的示意图。图3为采用双荧光素酶报告基因检测系统分析斜带石斑鱼IRF10基因的启动子活性图。图4为在细胞内polyI:C和细胞外polyI:C刺激后斜带石斑鱼IRF10基因的启动子活性的变化图。图5为重组质粒EcIRF10pro-pGL3的ISRE1、ISRE2和STAT调控元件突变后，细胞内polyI:C刺激前后斜带石斑鱼IRF10基因的启动子活性的变化图。图6为重组质粒EcIRF10pro-pGL3的ISRE1、ISRE2和STAT调控元件突变后，细胞外polyI:C刺激前后斜带石斑鱼IRF10基因的启动子活性的变化图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1：斜带石斑鱼IRF10基因启动子的克隆1.1斜带石斑鱼(市场购买)基因组DNA的提取参照《分子克隆实验指南三》提供的酚-氯仿抽提方法，用0.6％的琼脂糖凝胶电泳检测斜带石斑鱼基因组DNA质量。设计三条特异性引物：SP1：5`-TGTTTCCTCTAATCTACGACGGGAC-3`SEQIDNO:2；SP2：5`-GACAGAGCAGCACAAAGATAGCTGG-3`SEQIDNO:3；SP3：5`-CAGTGTCGACCTTGAAGAGAGCTGC-3`SEQIDNO:4；AP1：5`-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3`SEQIDNO:5；1.2参照Takara公司的GenomeWalkingKit说明书，采用三轮巢式PCR反应扩增出斜带石斑鱼IRF10基因启动子序列，具体步骤如下：①第一轮巢式PCR反应体系：PCR程序见表1。表1PCR程序表②第二轮巢式PCR以第一轮PCR产物为模板，利用AP1Primer和特异性引物SP2进行，其它成分和体系与第一轮相同。PCR程序见表2。表2PCR程序表③第三轮巢式PCR以第二轮PCR产物为模板，利用AP1Primer和特异性引物SP3进行，其它成分、体系和程序与第二轮相同。...

【技术保护点】
1.一种斜带石斑鱼IRF10基因启动子，其特征在于，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：/na、Seq ID No.1所示的核苷酸序列；/nb、与Seq ID No.1互补的核苷酸序列；/nc、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；/nd、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；/ne、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种斜带石斑鱼IRF10基因启动子，其特征在于，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：
a、SeqIDNo.1所示的核苷酸序列；
b、与SeqIDNo.1互补的核苷酸序列；
c、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；
e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。


2.一种核酸构建体，包含权利要求1所述的启动子，与启动子可操作连接的基因序列，其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。


3.一种载体，其特征在于：所述载体含有权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体；优选的，所述载体为权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄贝，王志轩，李文星，张楚，梁英，黄文树，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35