两亲性寡肽结构物质制造技术

本发明专利技术公开了一种两亲性寡肽结构物质，以亮氨酸‑亮氨酸‑组氨酸‑组氨酸（LLHH）基本序列为母核序列，形成的寡肽结构为（LLHH）n，其中的n为1‑9中的一种。优选以重量比以1:1、5:1、10:1、20:1、40:1混合制备的cRGD‑R9‑(LLHH)n/siEGFR自组装纳米给药系统。该两性寡肽结构与其它成分通过化学键形成偶联物后用作给药系统，可提高给药系统所载药物分子进入细胞的摄取量，促进所载药物分子从内含体逃逸进入胞浆，从而提高药物分子的生物学活性。

【技术实现步骤摘要】
两亲性寡肽结构物质
本专利技术属于生物医药领域中的一种提高药物分子生物学活性的技术。
技术介绍
双（2,4-二硝基苯）-L-组氨酸是一种化学物质，化学式是C18H13N7O10。实现多肽、蛋白质、核酸或化合物等药物分子对细胞内靶标有疗效的前提，是合适的给药系统携带这些药物分子首先依赖于内吞途径作为主要摄取机制进入细胞内，然后在细胞内从内含体（Endosome，或称内体）转运至溶酶体降解前的过程中释放至胞浆中，作用于靶点才能发挥疗效；否则，这些药物或降解或外排出细胞外失去疗效。反之，如果要提高这些药物分子的疗效，除了使用合适的给药系统将药物带入靶组织细胞内，提高药物分子从内含体逃逸出来进入胞浆内的数量，是提高药物疗效的重要和难度最大的选择（PeiD,BuyanovaM.OvercomingEndosomalEntrapmentinDrugDelivery[J].BioconjugChem,2019,30(2):273-283.）。小干扰RNA（siRNA）可特异性沉默靶标mRNA表达水平（2006年诺贝尔生理医学奖），因此siRNA分子可以通过特异性沉默引起或促进疾病发生或发展的基因，具有治疗基因过表达及基因突变引起的疾病的广泛应用前景（Science,2016,352(6292):1417-1420；NatChemBiol,2006,2(12):689-700.）。将siRNA分子药物输送到靶细胞中治疗疾病，所有的给药方式最终都会出现内含体内siRNA分子逃逸进入胞浆内的困难深渊，是目前实现siRNA广泛治疗组织疾病（肝脏靶向除外）而疗效欠缺的最关键因素（DowdySF.OvercomingcellularbarriersforRNAtherapeutics.NatBiotechnol.2017Mar;35(3):222-229.）。目前国内外研究用两大类方式增加内含体内siRNA分子的逃逸：1）破坏内体膜结构增加药物释放[Huet-CalderwoodC,Rivera-MolinaF,IwamotoDV,KromannEB,ToomreD,CalderwoodDA.Novelecto-taggedintegrinsrevealtheirtraffickinginlivecells[J].NatCommun,2017,8(1):570.]。使用小分子来破坏或溶解内体的脂质双层膜，如氯喹或溶酶肽等，让内体中有更多的siRNA释放进入胞浆中；但目前使用的这些小分子在细胞内产生了不可接受的毒性，或还不能使内体膜足够去稳定达到临床疗效逃逸所需的siRNA数量（相差1-2个数量级）。2）抑制循环，增加内体药物逃逸的机会，抑制内体转运外排，延长其在胞浆内的循环时间，使得内体中的siRNA有更长的时间和更多的机会逃逸进入胞浆中，如缺少人源胆固醇转运蛋白（NPC1）时，脂质纳米粒（LNPs）滞留在增大的内体/溶酶体内，不能外排出细胞，增加了内体siRNA逃逸的机会，提高了基因沉默效率。总之，目前还没有特别有效且适合临床使用提高内体药物逃逸的方法（DowdySF.OvercomingcellularbarriersforRNAtherapeutics.NatBiotechnol.2017Mar;35(3):222-229.）。申请号：2015101297927一种手性双L-亮氨酸盐酸盐的制备，该手性双L-亮氨酸盐酸盐的合成方法是称取0.03molL-亮氨酸（3.9354g）放入100ml的圆底烧瓶中，加入40ml无水甲醇并搅拌使其溶解，称取0.01molCuCl2·2H2O（1.7048g）加入上述溶液，加热回流反应48h。反应结束后趁热过滤反应溶液，得到饱和溶液，滤液自然挥发，两天后析出绿色晶体。该化合物没有组氨酸的结构成分。申请号：2017110762931专利技术公开了一种从血粉中分离提取亮氨酸和组氨酸的方法，血粉用酸水解，除渣，加入邻二甲苯磺酸沉淀亮氨酸，过滤分离得亮氨酸复合物沉淀和母液A，亮氨酸复合物沉淀经脱除沉淀剂、精制制得亮氨酸纯品；母液A脱除邻二甲苯磺酸后，加入二氯苯磺酸沉淀组氨酸，过滤分离得组氨酸复合物沉淀和母液B，组氨酸复合物沉淀经脱除沉淀剂、精制制得组氨酸纯品。该专利技术是分别提取两种成分，但不能获得两种成分的化合物或聚合物。补充对两亲性的解释：两亲性(amphipathy)是指分子同时具有亲水性和亲油性，亲水性和亲油性是特定基团的性质，物质的两亲性通常与它的化学结构有关。如构成细胞膜的磷脂双分子层中，单个磷脂的顶部由磷的官能团和甘油构成，呈亲水性；而尾部含饱和及不饱和脂肪酸，呈疏水性或亲油性，故磷脂分子整体呈两亲性。
技术实现思路
专利技术目的：提供一种含寡肽结构、能提高进入胞浆内的药物数量和生物学活性的两亲性寡肽结构物质。技术方案：本专利技术的两亲性寡肽结构物质，采用下列工艺合成获得：1、合成（LLHH）n结构：在本专利技术中，根据细胞内含体的结构特征和对药物逃逸内含体机制的理解，设计并采用Fmoc多肽固相合成技术筛选获得了一种以亮氨酸-亮氨酸-组氨酸-组氨酸（LLHH）基本序列为母核序列的两性寡肽结构，以母核序列为基础，可以合成多聚体亮氨酸-亮氨酸-组氨酸-组氨酸寡肽结构（（LLHH）n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9（n=1的结构比较简单，不是多聚结构，可舍去），该多聚体寡肽呈α螺旋结构，利于细胞摄取和生物活性分子从内含体逃逸进入胞浆内。该两性寡肽结构与其它成分通过化学键形成偶联物后，可用作给药系统；含（LLHH）1-9两性寡肽结构的给药系统，可提高给药系统所载药物分子进入细胞的摄取量，促进所载药物分子从内含体逃逸进入胞浆，从而提高药物分子的疗效。2、构建肿瘤靶向的核酸给药系统cRGD-R9-(LLHH)n：整合素αvβ3受体仅表达于肿瘤新生血管内皮细胞膜及部分肿瘤细胞膜，是研究小核酸（siRNA）等药物靶向治疗肿瘤的常用递送靶点；寡肽cRGD是αvβ3受体的特异性配体，研究发现cRGD可以将以非化学键方式囊化或化学键方式偶联携带的小核酸（siRNA）等药物分子靶向递送进入αvβ3受体表达的肿瘤细胞，实现药物杀死肿瘤细胞的目的（ParkJ,SinghaK,SonS,KimJ,NamgungR,YunCO,KimWJ.AreviewofRGD-functionalizednonviralgenedeliveryvectorsforcancertherapy[J].CancerGeneTher,2012,19(11):741-748.）。3、为了增加cRGD介导的给药系统中药物逃逸进入胞浆中的数量，提高药物治疗效果，本专利技术将(LLHH)n结构嵌合进入cRGD分子，获得了cRGD-R9-(LLHH)n结构，其中的R9为9个精氨酸的线性寡肽，含正电荷，可吸附含负电荷的小核酸（siRNA）分子，自组装形成纳米粒；n为1，2，3，4，5，6，7，8或9，得到肿瘤靶向的核酸给药系统cRGD-R9-(L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种两亲性寡肽结构物质，其特征在于：以亮氨酸-亮氨酸-组氨酸-组氨酸（LLHH）基本序列为母核序列的两性寡肽结构，以母核序列为基础，合成多聚体亮氨酸-亮氨酸-组氨酸-组氨酸寡肽结构，形成的寡肽结构为（LLHH）n，其中的n为1、2、3、4、5、6、7、8或9，该多聚体寡肽呈α螺旋构象。/n

【技术特征摘要】
1.一种两亲性寡肽结构物质，其特征在于：以亮氨酸-亮氨酸-组氨酸-组氨酸（LLHH）基本序列为母核序列的两性寡肽结构，以母核序列为基础，合成多聚体亮氨酸-亮氨酸-组氨酸-组氨酸寡肽结构，形成的寡肽结构为（LLHH）n，其中的n为1、2、3、4、5、6、7、8或9，该多聚体寡肽呈α螺旋构象。


2.如权利要求1所述的两亲性寡肽结构物质，其特征在于：是将(LLHH)n结构嵌合进入cRGD分子，获得的cRGD-R9-(LLHH)n结构，其中的寡肽cRGD是αvβ3受体的特异性配体，R9为9个精氨酸的线性寡肽。


3.如权利要求2所述的两亲性寡肽结构物质，其特征在于：将cRGD-R9-(LLHH)n寡肽材料与吸附含负电荷的小核酸siRNA分子按重量比为1-40/1混合，于36-38℃孵育30分钟，形成cRGD与(LLHH)n功能团在外围，siRNA与R9为中心母核的cRGD-R9-(LLHH)n/siRNA自组装纳米递释系统。
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【专利技术属性】
技术研发人员：季爱民，岑柏宏，黎权辉，陈佳扬，陈漳浦，
申请(专利权)人：武汉泽智生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42