沉默小眼畸形转录因子mRNA表达的siRNA分子制造技术

本发明专利技术公开了一组沉默小眼畸形转录因子靶基因mRNA表达的小干扰RNA分子。本发明专利技术提供的siRNA的反义链由19‑29个核苷酸组成，正义链由15‑21个核苷酸组成；正义链与反义链之间有15‑19个核苷酸互补组成双链结构。本发明专利技术提供的siRNA中的所有核苷酸或部分核苷酸等2’‑核糖上可以进行修饰，防止核苷酶降解。本发明专利技术提供的siRNA分子或同源性大于60%的分子结构，可单独或联合使用，对靶基因MITF mRNA表达的沉默效率达到40%以上，可治疗MITF突变或过表达引起的疾病或皮肤色素沉着。

SiRNA molecule silencing the expression of transcription factor mRNA in microphthalmos

The invention discloses a group of small interfering RNA molecules for silencing the mRNA expression of the target gene of microphthalmos transcription factor. The antisense chain of the siRNA provided by the invention is composed of 19 \u2011 29 nucleotides, and the sense chain is composed of 15 \u2011 21 nucleotides; there are 15 \u2011 19 nucleotides complementary between the sense chain and the antisense chain to form a double chain structure. The 2 \u2011 ribose such as all or part of the nucleotides in the siRNA provided by the invention can be modified to prevent nucleoside enzyme degradation. The siRNA molecule or molecular structure with homology greater than 60% provided by the invention can be used alone or in combination, the silencing efficiency of target gene expression of MITF mRNA can reach more than 40%, and the disease or skin pigmentation caused by MITF mutation or overexpression can be treated.

【技术实现步骤摘要】
沉默小眼畸形转录因子mRNA表达的siRNA分子
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种沉默基因或蛋白质表达的siRNA序列及其应用。
技术介绍
小眼畸形相关转录因子(Microphthalmia-AssociatedTranscriptionFactor，MITF)具有典型的螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链结构（basichelix-loop-helixleucinezipper,bHLXZp），属于MiT转录因子超家族成员（TachibanaM,etal.MITF:astreamflowingforpigmentcells.PigmentCellRes.2000;13(4):230-240.）。研究发现MITF主要在色素细胞中表达，包括成黑色素细胞（melenoblast）和视网膜色素上皮细胞（retinalpigmentepithelium,RPE），其它如肥大细胞和破骨细胞等中也有表达（CarreiraS,etal.MITFregulationofDialcontrolsmelanomaproliferationandinvasiveness.GenesDev.2006;20(24):3426-3439.）。皮肤黑色素细胞来源于神经嵴，人类皮肤分布着大量成熟黑色素细胞，这些表皮色素细胞具有分裂共那个和杀菌作用，能够抵抗紫外线和其它外界刺激，MITF深入参与其分化（SlominskiA.Neuroendocrineactivityofthemelanocyte.ExperimentalDermatology.2009;18:(9)760-763.）。研究发现，MITF参与色素沉着过程，直接作用色素生成相关基因的转录调节。MITF可激活黑色素细胞中的酪氨酸酶（tyrosinase,TYR）、酪氨酸酶相关蛋白1（tyrosinaserelatedprotein2,TYRP2）及酪氨酸酶相关蛋白1（tyrosinaserelatedprotein2,TYRP2）等基因的表达。黑色素是一组天然色素，来源于表皮下的黑色素细胞。黑色素保护人类皮肤免受有害的紫外线辐射(UVR)和不同来源的环境污染物、有毒药物和化学品的压力。皮肤黑素细胞产生异常高的黑色素或黑色素生成会导致色素沉着障碍，如黄褐斑、老年性斑、雀斑、及色素痤疮疤痕。黑色素生成是一个多步骤的生理过程，导致合成一种复杂的深色生物聚合物，称为“黑色素”，是黑色素细胞中与溶酶体相关的细胞器，有助于保护皮肤免受阳光、有毒药物和化学物质的有害影响。黑色素有两种类型：真黑素（eumelanin)及褐黑素（pheomelanin)。在黑色素生成过程中，有3种主要酶参与：酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(Tyrp1)和酪氨酸酶相关蛋白2(Tyrp2）。所有黑色素生成信号通路都与黑素生成的主要调控因子MITF(microphthalmia-associatedtranscriptionfactor，小眼畸形相关转录因子)有关，MITF调控黑色素生成基因TYR、Tyrp1和Tyrp2的表达。黑色素生成过程及信号传导途径种的关键限速细胞因子为MITF，抑制MITF的表达，具有抑制皮肤色素沉着使皮肤增白的功效。在人类中，MITF控制黑色素细胞中正常黑色素合成所必需的各种基因的表达，MITF的突变可导致黑色素瘤、Waardenburg综合征和Tietz综合征等疾病(HodgkinsonCA,etal.Mutationatthemousemicrophthalmialocusareassociatedwithdefectsinageneencodinganovelbasic-helix-loop-helix-zipperprotein.Cell.1993;74(2):395-404.)。除此以外，MITF与细胞周期、分化、衰老、凋亡、增殖和迁移等生物学行为相关。MITF高表达于黑色瘤细胞系，促进增殖相关转录因子T-box2的表达，从而促进黑色瘤增殖。另外，MITF调控细胞周期依赖性蛋白激酶2（cyclin-dependentkinase,CDK2）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A/B（cyclin-dependentkinaseinhibitor1A/B,CDKN1A/B），从而调控细胞生长周期。MITF通过上调B细胞淋巴瘤因子-2（Bcelllymphoma-2,Bcl-2）和C-MET等抗凋亡蛋白促进肿瘤的发展。缺氧诱导因子-1α（hypoxiainduciblefactor-1α）在黑色素瘤中不仅具有抗凋亡作用，还可刺激血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）的生成。研究发现，MITF可转录激活HIF-1α，从而促进肿瘤血管生成。其它细胞因子如蛋白透光形成素（diaphanousrelatedformin1,Dial）、miR-211和β-catenin等与黑色素瘤浸润密切相关的蛋白编码基因也受到MITF调控（CheliY,etal.Oncogene.2012;31(19):2461-2470.;ArozarenaI,etal.InMelanoma,beta-cateninisasuppressorofinvasion.Oncogene.2011;30(45):4531-4543.）。因此，抑制MITF的基因表达，从而抑制MITF的功能，具有治疗黑色瘤的应用前景。MITF是重要的转录因子，它在生物体生命活动过程中扮演着不可或缺的角色，影响着生物体的生长、发育、分化和衰亡的各个时期，特别对动物的毛发形成具有重要的生物学意义。目前认为MITF在黑色素细胞及色素生成调控方面的作用尤其重要。小干扰RNA（siRNA）可特异性沉默靶标mRNA表达水平（2006年诺贝尔生理医学奖），因此siRNA分子可以通过特异性沉默引起或促进疾病发生或发展的基因，具有治疗基因过表达及基因突变引起的疾病的应用前景（Science,2016,352(6292):1417-1420；NatChemBiol,2006,2(12):689-700.）。在siRNA双链中，能与Argonaute蛋白（AGO蛋白）组成RNA干扰沉默复合物（RISC）的那条单链称为反义链（Antisensestrand）或向导链（Guidestrand），该链形成的RISC复合物能与靶mRNA结合，切割并沉默靶mRNA。而另外一条无功能的单链称之为正义链（sensestrand）或过客链（Passengerstrand）。利用siRNA分子的特征，可以设计多条沉默靶基因的siRNA序列（NatureReviewsGenetics,2015,16(9):543-552）。
技术实现思路
专利技术目的：提供一种能有效沉默黑色素细胞及黑色素瘤细胞表达的MITFmRNA表达水平的sIRNA及其应用。技术方案：在本专利技术中，采用RNAi原理，设计并筛选获得特异性沉默MITFmRNA表达的siRNA序列，用得到的siRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种沉默小眼畸形转录因子mRNA表达的siRNA序列，siRNA序列为正义链和反义链组成双链结构分子的核苷酸序列，其特征在于：所述的siRNA序列的靶序列、正义链和反义链分别为下列品种中的一种：/nsiMITF-m-2:/n靶序列：CTGGAAATGCTAGAATATA，/n正义链：5'-CUGGAAAUGCUAGAAUAUAdTdT-3'，/n反义链：5'-UAUAUUCUAGCAUUUCCAGdTdT-3'；/nsiMITF- m-5：/n靶序列：CCTAGAATCAAGTTATAAT，/n正义链：5'-CCUAGAAUCAAGUUAUAAUdTdT-3'，/n反义链：5'-AUUAUAACUUGAUUCUAGGdTdT-3'；/nsiMITF- m-8:/n靶序列：GAACGAAGAAGAAGATTTA，/n正义链：5'-GAACGAAGAAGAAGAUUUAdTdT-3'，/n反义链：5'-UAAAUCUUCUUCUUCGUUCdTdT-3'；/nsiMITF- m-9:/n靶序列：GAAGAAGATTTAACATAAA，/n正义链：5'-GAAGAAGAUUUAACAUAAAdTdT-3'，/n反义链：5'-UUUAUGUUAAAUCUUCUUCdTdT-3'；/nsiMITF- m-10:/n靶序列： CCACTTTAGCAAATAAACA，/n正义链：5'-CCACUUUAGCAAAUAAACAdTdT-3'，/n反义链：5'-UGUUUAUUUGCUAAAGUGGdTdT-3'。/n...

【技术特征摘要】
1.一种沉默小眼畸形转录因子mRNA表达的siRNA序列，siRNA序列为正义链和反义链组成双链结构分子的核苷酸序列，其特征在于：所述的siRNA序列的靶序列、正义链和反义链分别为下列品种中的一种：
siMITF-m-2:
靶序列：CTGGAAATGCTAGAATATA，
正义链：5'-CUGGAAAUGCUAGAAUAUAdTdT-3'，
反义链：5'-UAUAUUCUAGCAUUUCCAGdTdT-3'；
siMITF-m-5：
靶序列：CCTAGAATCAAGTTATAAT，
正义链：5'-CCUAGAAUCAAGUUAUAAUdTdT-3'，
反义链：5'-AUUAUAACUUGAUUCUAGGdTdT-3'；
siMITF-m-8:
靶序列：GAACGAAGAAGAAGATTTA，
正义链：5'-GAACGAAGAAGAAGAUUUAdTdT-3'，
反义链：5'-UAAAUCUUCUUCUUCGUUCdTdT-3'；
siMITF-m-9:
靶序列：GAAGAAGATTTAACATAAA，
正义链：5'-GAAGAAGAUUUAACAUAAAdTdT-3'，
反义链：5'-UUUAUGUUAAAUCUUCUUCdTdT-3'；
siMITF-m-10:
靶序列：CCACTTTAGCAAATAAACA，
正义链：5'-CCACUUUAGCAAAUAAACAdTdT-3'，
反义链：5'-UGUUUAUUUGCUAAAGUGGdTdT-3'。


2.根据权利1所述的沉默小眼畸形转录因子mRNA表达的siRNA序列，其特征在于：为采用Westernblot方法测试所获知的沉默效率较高的下列靶序列、正义链和反义链构成的siRNA序列中的一种：
siMITF-m-5：
靶序列：CCTAGAATCAAGTTATAAT，
正义链：5'-CCUAGAAUCAAGUUAUAAUdTdT-3'，
反义链：5'-AUUAUAACUUGAUUCUAGGdTdT-3'；
siMITF-m-8:
靶序列：GAACGAAGAAGAAGATTTA，
正义链：5'-GAACGAAGAAGAAGAUUUAdTdT-3'，
反义链：5'-UAAAUCUUCUUCUUCGUUCdTdT-3'；
siMITF-m-9:
靶序列：GAAGAAGATTTAACATAAA，
正义链：5'-GAAGAAGAUUUAACAUAAAdTdT-3'，
反义链：5'-UUUAUGUUAAAUCUUCUUCdTdT-3'。


3.根据权利1或2述的沉默...

【专利技术属性】
技术研发人员：季爱民，岑柏宏，黎权辉，黄文，
申请(专利权)人：武汉泽智生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42