Sal-miR-1和Sal-miR-3及其在制备药物中的用途制造技术

本发明专利技术属于医药技术领域，具体涉及两种小分子活性成分及其在制备药物组合中的应用，更具体的涉及丹参来源的两种miRNA：Sal‑miR‑1和Sal‑miR‑3，其在制备用于治疗血管重塑性疾病药物中的应用，本发明专利技术还提供所述miRNA的制备方法，以及含有上述miRNA的组合物，所述组合物选自片剂、胶囊剂或注射剂。为验证Sal‑miR‑1和Sal‑miR‑3的作用，本发明专利技术在小鼠体内颈动脉结扎模型中应用制备的Sal‑miR‑1和Sal‑miR‑3进行联合治疗，还在体外培养的血管平滑肌细胞中给予Sal‑miR‑1和Sal‑miR‑3联合治疗进行分子机制研究。为临床治疗血管重塑提供一种高效、低毒的新型药物奠定基础，为研发治疗血管重塑提供体内药效学及作用机制及理论实验依据，为科技成果转化创造条件。

Sal-mir-1 and sal-mir-3 and their use in the preparation of drugs

The invention belongs to the technical field of medicine, in particular to two small molecule active ingredients and their application in the preparation of drug combinations, more specifically to two miRNAs from Salvia miltiorrhiza: sal \u2011 Mir \u2011 1 and sal \u2011 Mir \u2011 3, which are used in the preparation of drugs for the treatment of vascular remodeling diseases, the invention also provides the preparation method of the miRNA and the composition containing the miRNA, The composition is selected from tablet, capsule or injection. In order to verify the effect of sal \u2011 Mir \u2011 1 and sal \u2011 Mir \u2011 3, the invention applies the prepared sal \u2011 Mir \u2011 1 and sal \u2011 Mir \u2011 3 in the model of ligation of carotid artery in mice for joint treatment, and also gives sal \u2011 Mir \u2011 1 and sal \u2011 Mir \u2011 3 combined treatment in vitro cultured vascular smooth muscle cells for molecular mechanism study. It lays a foundation for clinical treatment of vascular remodeling to provide a new drug with high efficiency and low toxicity, provides pharmacodynamics, mechanism of action and theoretical and experimental basis for research and development of treatment of vascular remodeling, and creates conditions for the transformation of scientific and technological achievements.

【技术实现步骤摘要】
Sal-miR-1和Sal-miR-3及其在制备药物中的用途
本专利技术属于医药
，具体涉及两种小分子活性成分及其在制备药物中的应用，更具体的涉及丹参来源的两种miRNA——Sal-miR-1和Sal-miR-3在制备用于治疗血管重塑性疾病药物中的应用。
技术介绍
血管重塑是血管为适应内外环境变化而发生的结构和功能的改变。血流动力学变化或代谢紊导致血管内皮损伤时，损伤部位产生的生长因子、血管活性物质，可诱导血管平滑肌细胞表型转化、增殖和迁移，同时伴随着细胞外基质的合成、降解和骨架的重新排布。血管在发育过程中，为应对不断变化的灌注压，其结构发生不断的变化，逐渐形成成熟的血管网络，如血管动脉的形成或是胚胎血管新生等过程均属于生理性血管重塑。而当血管壁无法承受外界应激时，其组织结构和功能就会发生病理性改变，产生病理性血管重塑，进而发生一系列的心血管疾病，如动脉粥状硬化、动脉瘤和血管内皮增生等。血管内皮细胞，平滑肌细胞和单核巨噬细胞均参与血管重塑过程，在血管重塑的过程中，常常伴随着血管平滑肌细胞增殖、迁移和异常的表型转化等，血管平滑肌细胞中这些细胞生物学行为的改变，对发生血管重塑起到至关重要的作用。近年，虽然在血管重塑发病机制研究方面取得很大进展，但尚缺乏逆转或减轻血管重塑的理想药物。因此，临床迫切需要获得一种新型、高效、低毒、安全、价廉的用于治疗血管重塑的药物。而从传统中药中寻找抗血管重塑的有效成分成为当前的研究热点之一。
技术实现思路
为克服现有技术之缺陷，本专利技术提供能够抑制血管平滑肌细胞增殖和对单核细胞黏附反应，从而能够有效治疗血管重塑的药物。丹参是唇形科植物的干燥根部和根茎，具有清心除燥、通经止痛、活血化瘀、凉血消痈的功效，在亚洲国家被广泛用于治疗冠心病、心肌梗死、心绞痛和动脉粥样硬化(AS)，是重要的心脑血管保护药物。丹参具有降低血液粘稠度、抑制动脉粥样硬化斑块形成、抑炎、抑制内膜增生、抗氧化、促进血管新生、改善内皮细胞功能等作用。其中，抑制血管内膜增生是丹参发挥心血管保护作用的重要机制之一。近年研究表明，丹参酮I、丹参酮IIA、丹参酮IIB、二氢丹参酮、隐丹参酮等亲油性成分以及丹参素、丹参酚酸A、B、原儿茶醛等亲水成分均可抑制血管平滑肌细胞增殖而发挥抑制内膜增生的作用，但其在影响血管平滑肌细胞对单核细胞的黏附，并作用于哪些黏附因子的研究并不详尽。自从南京大学张辰宇教授等，于2012年首次报道在人体血液中检测出大米miR-168a，并调控人低密度脂蛋白受体衔接蛋白1基因(LDLRAP1)。这说明了人体也可以吸收来自植物里的miRNAs。这些植物miRNAs经口服进入消化道后，不仅能稳定生存下来，还能被机体吸收进入血循环，从而在不同靶器官发挥作用。这就打破外源性miRNAs会被机体核酸酶降解而失去调控能力的结论，还可以进行跨物种的传递调节，为摄入性获取外源性miRNAs的研究和临床应用提供新思路，对中国传统中药药理的作用机制研究具有十分深远的影响。还有研究发现，稳定存在于中药金银花汤剂中的金银花miRNAs，可以通过小鼠灌胃方式进入小鼠循环系统，并有效抑制小鼠体内的流感病毒A。本专利技术经对丹参提取成分进行二代高通量测序，筛选并鉴定了特异性存在于丹参中的2种miRNA，命名为Sal-miR-1和Sal-miR-3。将丹参的有效成分单一化并合成、体外实验抑制黏附机制的研究、动物模型的建立等，发现丹参来源的miRNA，Sal-miR-1和Sal-miR-3联合治疗在抑制血管内膜增生形成中发挥抑制血管对单核细胞黏附反应的作用。因此，本专利技术解决现有技术问题的技术方案如下所述。本专利技术提供2种miRNA，命名为Sal-miR-1和Sal-miR-3，分别具有如下序列。namesequenceSal-miR-1cgtaaagacctctgatgagagtgSal-miR-3gaggcattgagggagaagt本专利技术提供所述Sal-miR-1和Sal-miR-3在制备联合治疗血管重塑中的药物组合中的用途。本专利技术提供所述Sal-miR-1和Sal-miR-3在制备用于治疗血管平滑肌增生性疾病的药物组合中的用途。上述用途中，两种miRNA的摩尔比例为1:1。本专利技术还提供所述miRNA的制备方法，含有如下步骤：1、植物总RNA的提取1)将丹参的干燥根和根茎组织进行液氮研磨，保证无块状组织，取100mg粉末置于2mL无菌离心管中，添加500μLBufferRCL/β-巯基乙醇，(样品解冻之前加入β-巯基乙醇)，快速混匀；2)55℃水浴1-3min，室温，14,000g离心5min；3)吸取上清液(大概可获得450μL)，加入至含有2mL收集管的gDNAFilterColum中，室温14,000g离心2min；4)加入等倍体积的BufferRCB于收集管中，并上下颠倒混匀5-10次；5)将从(4)中得到的全部混合液包括沉淀置于HiBindRNAminiColum，加入一个新的2mL收集管，室温10,000离心1min，除去流动相，并把柱子放回收集管中；6)加入400μLRWCWashBuffer置于柱子中，室温10,000g离心1min除去流动相，柱子放回收集管中；此时，可选择用DNAaseⅠ处理；7)把柱子放在一个新的2mL收集管中，加入500μLRNAWashBufferⅡ，室温10,000g离心1min，除去流动相，并把柱子放回收集管中；8)重复(7)，把柱子放回收集管中，10,000g离心2min，离心干燥；9)将离心柱置于新的1.5mL离心管中，在离心柱中加入30-50μLDEPC水，室温静置2min后，全速(≥13,000g)离心1min，将流出液收集，-80℃保存；2、丹参RNA建库测序流程从RNA样品到最终数据获得，样品检测、建库、测序每一个环节都会对数据质量和数量产生影响，而数据质量又会直接影响后续信息分析的结果；为了从源头上保证测序数据的准确性、可靠性，对样品检测、建库、测序每一个步骤都严格把控，确保高质量数据的产出；流程图如附图2。2.1TotalRNA样品检测对RNA样品的检测主要包括4种方法：(1)琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染；(2)Nanodrop检测RNA的纯度(OD260/280比值)；(3)Qubit对RNA浓度进行精确定量；(4)Agilent2100精确检测RNA的完整性；2.2文库构建样品检测合格后，使用SmallRNASamplePreKit构建文库，利用SmallRNA的3’及5’端特殊结构(5’端有完整的磷酸基团，3’端有羟基)，以totalRNA为起始样品，直接将SmallRNA两端加上接头，然后反转录合成cDNA；随后经过PCR扩增，PAGE胶电泳分离目标DNA片段，切胶回收得到的即为cDNA文库；构建原理图如附图1。2.3库检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种miRNA，具有如下序列，CGTAAAGACCTCTGATGAGAGTG。/n

【技术特征摘要】
1.一种miRNA，具有如下序列，CGTAAAGACCTCTGATGAGAGTG。


2.一种miRNA，具有如下序列，GAGGCATTGAGGGAGAAGT。


3.如权利要求1和2所述两种miRNA在制备用于治疗血管重塑性疾病的药物组合中的用途。


4.如权利要求1和2所述两种miRNA在制备用于治疗血管平滑肌细胞增殖性疾病的药物组合中的用途。


5.一种制备如权利要求1所述miRNA的方法，含有如下步骤：
①植物总RNA的提取
1)将丹参的干燥根和根茎组织进行液氮研磨，保证无块状组织，取100mg粉末置于2mL无菌离心管中，添加500μLBufferRCL/β-巯基乙醇，(样品解冻之前加入β-巯基乙醇)，快速混匀；
2)55℃水浴1-3min，室温，14,000g离心5min；
3)吸取上清液(大概可获得450μL)，加入至含有2mL收集管的gDNAFilterColum中，室温14,000g离心2min；
4)加入等倍体积的BufferRCB于收集管中，并上下颠倒混匀5-10次；
5)将从(4)中得到的全部混合液包括沉淀置于HiBindRNAminiColum，加入一个新的2mL收集管，室温10,000离心1min，除去流动相，并把柱子放回收集管中；
6)加入400μLRWCWashBuffer置于柱子中，室温10,000g离心1min除去流动相，柱子放回收集管中；此时，可选择用DNAaseⅠ处理；
7)把柱子放在一个新的2mL收集管中，加入500μLRNAWashBufferⅡ，室温10,000g离心1min，除去流动相，并把柱子放回收集管中；
8)重复(7)，把柱子放回收集管中，10,000g离心2min，离心干燥；
9)将离心柱置于新的1.5mL离心管中，在离心柱中加入30-50μLDEPC水，室温静置2min后，全速(≥13,000g)离心1min，将流出液收集，-80℃保存；
②丹参RNA建库测序流程
②.1TotalRNA样品检测
对RNA样品的检测主要包括4种方法：
(1)琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染；
(2)Nanodrop检测RNA的纯度(OD260/280比值)；
(3)Qubit对RNA浓度进行精确定量；
(4)Agilent2100精确检测RNA的完整性；
②.2文库构建
样品检测合格后，使用SmallRNASamplePreKit构建文库，利用SmallRNA的3’及5’端特殊结构(5’端有完整的磷酸基团，3’端有羟基)，以totalRNA为起始样品，直接将SmallRNA两端加上接头，然后反转录合成cDNA；随后经过PCR扩增，PAGE胶电泳分离目标DNA片段，切胶回收得到的即为cDNA文库；
②.3库检
文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/μL，随后使用Agilent2100对文库的insertsize进行检测，insertsize符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2nM)，以保证文库质量；
②.4上机测序
库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行HiSeq/MiSeq测序获取丹参中存在的植物源性的miRNA；
③植物miRNA的提取
1)将丹参的干燥根和根茎组织进行液氮研磨，保证无块状组织，取50-100mg粉末置于2mL无菌离心管中，添加700μLLysismixture，最高速度涡旋30s，充分混匀样品；
2)55℃水浴3min，室温，12,000g离心5min；
3)吸取上清液，加入至含有2mL收集管的gDNARemovelColum中，室温12,000g离心2min...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨高山，温进坤，郑斌，张新华，秦岩，
申请(专利权)人：河北医科大学，
类型：发明
国别省市：河北;13