基于PCR技术克隆已知区域旁邻的未知DNA序列的引物及方法技术

本发明专利技术涉及一种基于PCR技术克隆已知区域旁邻的未知DNA序列的引物及方法。引物包括5’端接头区域、中间简并区域和3’端锚定碱基三个组成部分，其中根据物种碱基的偏好性的不同，针对三种碱基群体分布，设计引物的简并区域。引物的设计结合优化后的PCR扩增反应，特异性强，适应性广，能有效地扩增出已知区域旁邻的未知DNA序列。其操作简便，仅需一轮交错热不对称PCR反应，大大节省了商业成本，增加了扩增效率。本发明专利技术采用同源重组的形式克隆PCR扩增产物，使非特异性产物在进行同源重组时可以成功的规避掉。同时，在扩增的目标片段为多条或不清晰时，也依然可以进行同源重组反应，获得完整清晰的目标序列。因此，显著减少了实验投入，提高实验效率。

PCR based primers and methods for cloning unknown DNA sequences adjacent to known regions

The invention relates to a primer and a method for cloning an unknown DNA sequence adjacent to a known region based on PCR technology. The primer consists of three parts: 5 'terminal junction region, intermediate degenerate region and 3' terminal anchored base. According to the preference of the species base, the degenerate region of the primer is designed for the distribution of three base groups. The design of primers combined with the optimized PCR amplification reaction has strong specificity and wide adaptability, which can effectively amplify the unknown DNA sequence next to the known region. It is easy to operate and only needs a round of cross thermo asymmetric PCR reaction, which greatly saves the commercial cost and increases the amplification efficiency. The invention adopts the form of homologous recombination to clone PCR amplification products, so that the non-specific products can be successfully avoided in homologous recombination. At the same time, when the amplified target fragments are multiple or unclear, homologous recombination can still be carried out to obtain complete and clear target sequences. Therefore, the experiment investment is significantly reduced and the experiment efficiency is improved.

【技术实现步骤摘要】
基于PCR技术克隆已知区域旁邻的未知DNA序列的引物及方法
本专利技术涉及基因工程
，更具体地，涉及一种基于PCR技术克隆已知区域旁邻的未知DNA序列的引物及方法。
技术介绍
染色体步移(GenomeWalking)技术是一种由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目标序列的方法。对于已经完成基因组测序的模式生物种(如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等)，可以从数据库中轻松的找到已知序列的侧翼序列。但是目前为止，自然界绝大多数生物基因组DNA序列仍未知，要想知道一个已知区域两侧的DNA序列，只能通过染色体步移技术。传统的染色体步移方法有反向PCR、接头PCR、质粒拯救等技术。由于传统方法的效率低，实验繁琐，灵敏度特异性差，所以近年来研究出许多高效的染色体步移技术，如TAIL-PCR(交错式热不对称PCR)、HiTAIL-PCR(高效交错式热不对称PCR)、FPNI-PCR(整合融合引物和巢式PCR)等。这些技术主要应用于已知DNA片段侧翼序列的步移、T-DNA插入位点鉴定、基因组测序填补空隙等本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于PCR技术克隆已知区域旁邻的未知DNA序列的引物，其特征在于，包括简并引物和接头引物；所述简并引物根据物种碱基偏好性的不同，包括针对GC含量＞60％碱基序列的简并引物SEQ ID NO:1-4，针对40％≤GC含量≤60％碱基序列的简并引物SEQ ID NO:5-7，针对GC含量＜40％碱基序列的简并引物SEQ ID NO:8-11；所述接头引物序列如SEQ IDNO:12-14所示；其中R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝G/C，W＝A/T，H＝A/T/C，B＝G/T/C，V＝G/A/C，D＝G/A/T，N＝A/T/C/G。/n

【技术特征摘要】
1.基于PCR技术克隆已知区域旁邻的未知DNA序列的引物，其特征在于，包括简并引物和接头引物；所述简并引物根据物种碱基偏好性的不同，包括针对GC含量＞60％碱基序列的简并引物SEQIDNO:1-4，针对40％≤GC含量≤60％碱基序列的简并引物SEQIDNO:5-7，针对GC含量＜40％碱基序列的简并引物SEQIDNO:8-11；所述接头引物序列如SEQIDNO:12-14所示；其中R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝G/C，W＝A/T，H＝A/T/C，B＝G/T/C，V＝G/A/C，D＝G/A/T，N＝A/T/C/G。


2.一种基于PCR技术克隆已知区域旁邻的未知DNA序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以已知基因组DNA为模板，以权利要求1的简并引物和特异性引物GSP1为引物进行第一轮PCR扩增；所述简并引物选自SEQIDNO:1-2中的至少一种，或选自SEQIDNO:3-4中的至少一种，或选自SEQIDNO:5，或选自SEQIDNO:6-7中的至少一种，或选自SEQIDNO:8-9中的至少一种，或选自SEQIDNO:10-11中的至少一种；
(2)以第一轮PCR扩增产物为模板，以接头引物AdP1和特异性引物GSP2为引物进行第二轮PCR扩增；所述接头引物AdP1序列如SEQIDNO:12所示；
(3)以第二轮PCR扩增产物为模板，以接头引物AdP2和特异性引物GSP3为引物进行第三轮PCR扩增；
(4)回收第三轮PCR扩增产物，进行同源重组反应将目的片段克隆至载体，测序，得到完整的未知序列的信息。


3.根据权利要求2所述的一种基于PCR技术克隆已知区域旁邻的未知DNA序列的方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增反应扩增程序为：预变性90-95℃1-5min，91-97℃1-5min；(1)特异性反应90-96℃15-60s、T115-60s、68-75℃1-5min，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王高华，李阳，
申请(专利权)人：湖北伯远合成生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42