提高酶的可溶性表达的标签及方法技术

本发明专利技术提供了提高酶的可溶性表达的标签及方法，设计了可提高酶可溶性表达的标签序列，通过基因工程手段在原酶核苷酸序列C末端上连接融合标签label的核苷酸序列，导入表达载体，将重组表达载体转化至重组菌进行表达，可将酶的可溶性表达提高10～20倍左右。

Label and method of improving soluble expression of enzyme

The invention provides a label and a method for improving the soluble expression of an enzyme, designs a label sequence which can improve the soluble expression of an enzyme, connects the nucleotide sequence of the fusion label on the C end of the nucleotide sequence of the original enzyme by means of genetic engineering, imports the expression vector, transforms the recombinant expression vector into a recombinant bacterium for expression, and improves the soluble expression of the enzyme by about 10-20 times.

【技术实现步骤摘要】
提高酶的可溶性表达的标签及方法
本专利技术属于大肠杆菌蛋白高效表达和基因工程领域，具体涉及提高酶的可溶性表达的标签及方法。
技术介绍
大肠杆菌具有遗传性状了解透彻、生长快、培养经济、表达水平高、待选质粒和宿主多等特点，在基因工程
成为首选的表达系统，但是外源蛋白往往在获得高水平表达的同时，容易被宿主蛋白酶降解或者形成包涵体。提高外源蛋白质可溶性表达水平的方法有很多，包括使用弱启动子、降低诱导温度、优化培养基、与分子伴侣共表达等。但是由于表达系统的组件与蛋白质本身的关系暂未研究清，我们往往只能通过不断尝试来提高可溶性表达，耗时较长并且不易得到很好的效果。融合标签的开发和利用不仅方便蛋白质的纯化和检测，而且增强了重组蛋白可溶性表达，产量继稳定性方面也得到了广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种提高酶可溶性表达的标签，从而解决酶可溶性表达低的问题。所述标签具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。本专利技术的另一目的在于提供包含上述标签序列的重组表达载体，即含有所述重组表达载体的重组菌。本专利技术的又一目的在于提供一种提高酶可溶性表达的方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一种提高酶可溶性表达的方法，在酶基因的C端连接标签序列，导入表达载体，将重组表达载体转化至重组菌进行表达。其中所述标签序列如SEQIDNO：1所示。其中，所述重组表达载体的构建方式为：（1）以原酶的基因为模板，设计引物1和引物2，其中引物2带有接头序列Linker和标签序列label，通过PCR的方法获得C端连有label的原酶基因的PCR产物，命名为N-Linker-label；（2）将（1）中所得到的PCR产物N-Linker-label和载体进行双酶切反应，获得重组载体。进一步的，所述载体选用pET30a。进一步的，所述重组菌选用大肠杆菌BL21(DE3)。其中，上述发酵培养的培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L。本专利技术设计了一种普适性强的标签，利用基因工程的方法对原酶进行改造，通过C末端连接融合表达标签构建新的重组基因工程菌，以提高原酶的可溶性表达。所述的标签序列可应用于氧化还原酶类，不仅可提高酶的可溶性表达，且具有很好的普适性，具有良好的应用前景。附图说明图1是GDH-Linker-label构建过程。图2是pET30a-GDH-Linker-label构建过程。图3是改造前后葡萄糖脱氢酶可溶性表达的比较。图4是改造前后的葡萄糖脱氢酶温度稳定性的比较。图5是改造前后的葡萄糖脱氢酶pH稳定性的比较。图6是普适性实验可溶性表达量的比较。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。实施例1实施例1~实施例4以葡萄糖脱氢酶为例，具体本专利技术标签在提高酶可溶性表达中的应用方式。（1）以葡萄糖脱氢酶基因GDH为模板，设计引物1和引物2，其中引物2带有Linker和label，通过PCR的方法获得C端连有融合标签label的葡萄糖脱氢酶基因的PCR产物，命名为GDH-Linker-label。label的序列如SEQIDNO：1所示，GDH-Linker-label的构建过程如图1所示。引物1基因序列：GGAATTCCATATGATGTATCCGGATTTAAAAGG引物2基因序列：CCGCTCGAGTTTGGTGGGTTTATATGCATCGACCATAACGATGTGCGCGGAGCCCCCGCCGGAGCCCCCGCCACCGCGGCCTGCTTGGAATGPCR的体系为：2×TaqPlusmastermix（Taq酶预混合溶液）12.5uL，模板DNA2uL，引物11uL，引物21uL，ddH2O8.5uL。PCR反应进程为：1）95℃预变性5min；2）94℃预变性30s；3）55℃退火30s；4）72℃延伸40s；步骤2）-4）重复30个循环；5）72℃继续延伸30s，冷却至4℃。胶回收PCR产物。（2）将（1）中所得到的PCR产物GDH-Linker-label和pET30a进行双酶切反应，获得重组载体pET30a-GDH-Linker-label。pET30a-GDH-Linker-label的构建过程如图2所示。酶切位点为：NdeⅠ(CATATG)、XhoⅠ(CTCGAG)酶切体系为：ddH2O30uL，10×M5uL，DNA基因12uL，NdeI1uL，XhoI1uL，37℃反应4小时以上，获得酶切产物1和2。（3）用T4DNA连接酶将连接酶切产物1、2，得到重组载体。通过质粒大小（5500左右）判断GDH-Linker-label是否已连接上pET30a。连接体系为：10×T4DNA连接酶缓冲液2.5uL，DNA片段8uL，载体2uL，T4DNA连接酶1uL，ddH2O11.5uL，16℃过夜反应。（4）将重组载体pET30a-GHD-Linker-label转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株上，并涂布到含有卡那霉素的LB固体培养基上，过夜培养。分离抗硫酸卡那霉素的转化体，测序鉴定，测序结果表明获得的核苷酸包括GDH-Linker-label，序列如SEQIDNO：2所示，pET30a-GDH-Linker-label的基因序列如SEQIDNO：3所示。实施例2改造前后葡萄糖脱氢酶的诱导表达及纯化在超净台中挑取原葡萄糖脱氢酶菌株（作对照）以及改造后的菌株的单菌落于50mL的液体LB培养基中，加入50uL的卡那霉素（浓度为100mg/mL），在37℃，200rpm的条件下震荡培养9-12h，以此为种子液。按6%（体积比）的接种量接到50mL新鲜的LB培养基中，并加入50uL的卡那霉素，在37℃，200rpm的条件下，震荡培养1h，然后加入50uL的IPTG（浓度为100mg/mL），在20℃，200rpm的条件下诱导14h，收集菌液。然后5000rpm离心5min，弃上清，每50mL菌液离心出来的菌泥用1.5mLpH为7.4的PBS缓冲液重悬，超声破碎后，4℃、12000rpm离心30min，上清液过镍柱进行纯化。实施例3改造前后葡萄糖脱氢酶的可溶性比较对实施例2获取的2种纯化后的酶液对进行SDS-PAGE蛋白电泳，如图3所示，从蛋白图上可以直接观察到改造后的葡萄糖脱氢酶的可溶性表达相较于原葡萄糖脱氢酶，明显提高。使用NanoDrop分光光度计测算浓度后，比较可溶性表达量。GDH可溶性表达量为2.2mg/mL，在对其进行标签融合改造后可溶性表达量达到了33mg/mL。实施例4改造前后葡萄糖脱氢酶的温度、pH稳定性比较对实施例2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高酶可溶性表达的标签，其特征在于，具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高酶可溶性表达的标签，其特征在于，具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。


2.含有权利要求1所述核苷酸序列的重组表达载体。


3.含有权利要求2所述重组表达载体的重组菌。


4.一种提高酶可溶性表达的方法，其特征在于，在酶基因的C端连接标签序列，导入表达载体，将重组表达载体转化至重组菌进行表达；
所述标签序列如SEQIDNO：1所示。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶为氧化还原酶类。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶包括GDH、LeuDH、ZHD101、PV08、荧光素酶、CPC酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，冯小倩，徐晴，宋萍，张立慧，
申请(专利权)人：南京工业大学，南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32