用于识别或量化在生物样品中的靶标的方法和组合物技术

描述了包括一个或多个构建体的组合物、试剂盒和方法，每个构建体包括配体，该配体通过连接体与例如寡核苷酸序列的聚合物构建体连接或缀合，每个配体特异性结合位于细胞中或细胞表面上的单个靶标。聚合物构建体包括a)扩增柄；b)特异性识别单个配体的条形码；c)可选的独特分子标识符，该独特分子标识符定位于邻近条形码的5'或3'端；和d)锚，该锚用于与互补序列杂交，例如，用于产生双链寡核苷酸。这些组合物用在包括高通量方法的方法中，用于检测生物样品中的一个或多个靶标或表位。在高通量方法中还使用这些组合物用于通过同时检测位于细胞中或细胞上的一个或多个表位及其转录组来表征细胞。

Methods and compositions for identifying or quantifying targets in biological samples

A composition, kit, and method including one or more constructs, each of which includes a ligand, which is linked or conjugated by a linker to a polymer construct, such as an oligonucleotide sequence, each of which specifically binds to a single target in or on the surface of a cell are described. Polymer constructs include a) amplification handle; b) bar code that specifically identifies a single ligand; c) optional unique molecular identifier located at the 5 'or 3' end of the adjacent bar code; and D) anchors that are used to hybridize with complementary sequences, for example, to produce double stranded oligonucleotides. These compositions are used in methods including high-throughput methods for the detection of one or more targets or epitopes in biological samples. These compositions are also used in the high-throughput method for characterizing cells by simultaneously detecting one or more epitopes and their transcriptome located in or on cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于识别或量化在生物样品中的靶标的方法和组合物相关专利申请本专利申请要求2017年12月21日提交的美国临时专利申请No.62/609332、2017年12月15日提交的美国临时专利申请No.62/599450、2017年9月15日提交的美国临时专利申请No.62/559228、2017年8月23日提交的美国临时专利申请No.62/549189、2017年6月5日提交的美国临时专利申请No.62/515180和2017年2月2日提交的美国临时专利申请No.62/453726的权益。上述申请的全部内容(包括所有文本、表格、附图和序列)通过引用并入本文。关于联邦政府资助的研究或开发的声明本专利技术是在由美国国立卫生研究院授予的项目号R21-HG-009748的政府支持下进行的。政府对本专利技术有一定的权利。以电子形式递交的材料的引用并入申请人在此通过引用并入以电子形式一同提交的序列表材料。该文件标记为“NYGLIPP35PCT_ST25.txt”，日期为2018年1月23日，包含11kB。
技术介绍
在异质群体中表征个体细胞的能力在生物学研究和临床诊断中变得越来越重要。已证明现代单细胞RNA-seq(scRNA-seq)方法的无偏差和高通量性质对于描述异质细胞群非常有价值1-3。在单细胞基因组学之前，常规地使用策划组的针对细胞表面蛋白质的荧光标记的抗体(其通常是细胞活性和功能的可靠指标)来描述细胞状态7。最近的研究8,9已经证明了将来自细胞分选仪的“索引分选”测量值与单细胞转录组学相结合的潜能；该过程允许将免疫表型映射到转录组衍生的聚类。然而，基于液滴微流控1-3、微孔47,48或组合索引20,30的大规模平行方法与细胞计数不兼容，因此不能用蛋白质信息增强。同时测量单细胞中转录物和蛋白质的靶向方法在规模上有局限性，或者只能并行分析几个基因和蛋白质10-14。传统上，大多数分类方法依赖于细胞表面蛋白质的光学检测。分选细胞的下游分析为细胞表型和表征提供了另外的信息层。随着过去几年高通量测序成本的降低，出现了各种实验室方法来分离和测序单细胞的RNA内容(单细胞RNA测序，scRNA-seq)。最初的单细胞测序方法采用荧光激活细胞分选(FACS)以将细胞从群体分离并划分到微量滴定板的各个孔中，以便将它们的转录组的内容与特定细胞表面标志物的表达相关联。FACS/scRNA-seq方法虽然有效，但具有相对低的通量和实验偏差，因为只有先验选择的细胞类型被分选和测序。因此，这些方法不适合于发现新细胞群或用于表征需要分析数万个细胞的复杂组织。从基于板的方法转变到Fluidigm和Wafergen开发的微流控/纳米孔方法允许研究人员扩展到巨大数量的细胞，缓解通量瓶颈，避开FACS遇到的实验偏差，并使scRNA-seq所需的细胞捕获过程和文库制备过程自动化。最近采用基于液滴的微流控方法，如Dropseq1、InDrop2、10XGenomics3和Illumina/Bio-Rad产品，已允许scRNA-seq扩展到大量细胞。目前基于液滴的微流控平台以超过每秒1,000个液滴的速率产生纳升级大小的油包水乳液。具有独特分子条形码的微粒与细胞共封装在液滴中，允许对源自相同细胞的转录物进行分组。该方法通过每次实验产生数万个个体单细胞反应而显著提高了通量，同时实现与纳升体积试剂使用相关的显著成本降低。虽然单细胞基因组学中基于液滴的进展显著改变了scRNA-seq实验的规模，但这些方法存在关键的缺点：所有基于液滴的单细胞RNA测序方法都丢失了除了总体上蛋白质水平或特别是细胞表面蛋白质表达以外的重要表型信息(表1)。目前同时检测和/或测量单细胞中的转录物和蛋白质的方法基于使用有限数量的标志物的索引细胞分选与基于板的RNA测序8,9组合或者邻位连接测定(PLA及其衍生技术)与数字PCR10-13或质谱流式细胞术14组合。这些测定的规模有限和/或只能并行分析几个基因和蛋白质(参见表1以比较不同的技术)。虽然转录组可以充当细胞状态的详细读数，但已经表明，mRNA丰度通常不能良好代表蛋白质水平，特别是在发育过程中4-6。细胞表面标志物的表达传统上通过细胞计数法经由荧光标记的抗体测量，并且复杂细胞群可以通过它们表达的标志物的组合来表征。例如，近年来已经基于免疫系统和神经系统中的蛋白质标志物确定了细胞类型的精细地图7。这引领使用细胞计数法作为许多疾病领域的诊断和监测工具，最突出的是肿瘤学和免疫学。然而，基于FACS的方法在可以同时测定的标志物的数量方面，由于选择用于分析的细胞因已知表面标志物的选择而具有偏差的事实而受到限制。因此，需要更有效的组合物和方法用于定性和定量分析众多细胞靶标(和其他靶标)，以用于诊断和研究应用。
技术实现思路
在一个方面，组合物包括构建体，该构建体包括通过连接体与聚合物构建体(即寡核苷酸序列)连接或缀合的配体。配体被设计为与生物样品中的靶标特异性结合。聚合物构建体，例如，寡核苷酸序列，包括扩增柄；特异性识别配体的条形码；可选的随机分子标签(RMT)或独特分子标识符(UMI)，以下称为“UMI”，其定位于邻近条形码的5'或3'端；和锚，该锚用于与捕获序列杂交并用于随后产生双链序列，该捕获序列包括与锚互补的序列。在另一方面，配体和聚合物构建体之间的连接体可以是可切割的共价键。在另一方面，组合物可以进一步含有一个或多个“另外的”构建体，该“另外的”构建体与组合物中任何其他构建体的不同之处至少在于靶标、配体和条形码以及UMI中的至少一个。在又进一步的方面，组合物包括一个或多个“基本上相同”的构建体。在某些实施方式中，每个“基本上相同”的构建体与组合物中任何其他参考构建体(例如，“第一”构建体或“另外的”构建体)的不同之处仅在于可选的UMI的序列的身份或没有来自参考构建体的UMI。在又另一方面，试剂盒包括一个或多个本文描述的组合物和实施方式，以及可选的用于实施一个或多个方法的试剂。在另一方面，用于检测生物样品中的一个或多个靶标的方法使用本文描述的一个或多个组合物和构建体。在一个方面，靶标是细胞表面抗原或表位，并且组合物含有针对该靶标的单个构建体，即“第一”构建体。在另一个实施方式中，如上文所述和下文所限定的，组合物含有多个“基本上相同”的构建体(即与“第一”构建体基本上相同)，或针对不同的靶标并因此具有不同组分的一个或多个“另外的”构建体。该方法涉及使生物样品与一个或多个上述组合物接触。另外的步骤涉及洗涤以去除未结合的构建体，和/或使各个构建体中的每个锚序列与捕获序列杂交。另一步骤涉及延伸与锚序列杂交的捕获，以将构建体条形码、UMI和扩增柄复制到双链序列上。然后扩增或检测聚合物构建体条形码序列以鉴定生物样品是否表达或含有单个靶标、一个或多个另外的靶标，或多个靶标的组合。可替换地，样品中靶标的表达水平通过检测通过处理的样品中任何UMI的量或两个或更多个UMI的平均量归一化的相应的聚合物构建体条形码的量来确定。在另一方面，如上所述的方法包括在洗涤步骤后从与一个或多个针对检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在多重测定中检测样品或靶标的方法，所述方法包括：/na)使第一样品与第一构建体接触，所述第一构建体包括与第一寡核苷酸连接的第一配体，其中所述第一配体与第一靶标特异性结合，并且所述第一寡核苷酸包括：/ni)第一扩增柄，/nii)第一条形码，其特异性识别所述第一样品，和/niii)第一锚。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170202 US 62/453,726;20170605 US 62/515,180;20171.一种用于在多重测定中检测样品或靶标的方法，所述方法包括：
a)使第一样品与第一构建体接触，所述第一构建体包括与第一寡核苷酸连接的第一配体，其中所述第一配体与第一靶标特异性结合，并且所述第一寡核苷酸包括：
i)第一扩增柄，
ii)第一条形码，其特异性识别所述第一样品，和
iii)第一锚。


2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
b)使第二样品与第二构建体接触，所述第二构建体包括与第二寡核苷酸连接的第二配体，其中所述第二配体与第二靶标特异性结合，并且所述第二寡核苷酸包括：
i)第二扩增柄，
ii)第二条形码，其特异性识别所述第二样品，和
iii)第二锚。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一靶标和所述第二靶标是相同的靶标，并且可选地，所述第一扩增柄和所述第二扩增柄大致相同，并且可选地，所述第一锚和所述第二锚大致相同。


4.根据权利要求2或3所述的方法，进一步包括：
c)使所述第一样品和所述第二样品与第三构建体接触，所述第三构建体包括与第三寡核苷酸连接的第三配体，其中所述第三配体与第三靶标特异性结合，并且所述第三寡核苷酸包括：
(i)第三扩增柄，
(ii)第三条形码，其特异性识别所述第三配体，和
(iii)第三锚。


5.根据权利要求4所述的方法，进一步包括：
d)使所述第一样品和所述第二样品与第四构建体接触，所述第四构建体包括与第四寡核苷酸连接的第四配体，其中所述第四配体特异性结合第四靶标，并且所述第四寡核苷酸包括：
i)第四扩增柄，
ii)第四条形码，其特异性识别所述第四配体，和
iii)第四锚。


6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述第三扩增柄和所述第四扩增柄大致相同，并且不同于所述第一扩增柄和所述第二扩增柄。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一锚、所述第二锚、所述第三锚和所述第四锚大致相同，并且可选地包括长度为至少10个核苷酸的多聚A序列。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第三靶标和所述第四靶标是不同的靶标，并且可选地，所述第三靶标与所述第一靶标或所述第二靶标不同，并且可选地，所述第四靶标与所述第一靶标或所述第二靶标不同。


9.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，进一步包括：
e)使第三样品与第五构建体接触，所述第五构建体包括与第五靶标特异性结合的第五配体，其中所述第五靶标可选地与所述第一靶标相同，并且所述第五配体与第五寡核苷酸连接，所述第五寡核苷酸包括：
i)第五扩增柄，所述第五扩增柄可选地与所述第一扩增柄大致相同，
ii)第五条形码，其特异性识别所述第三样品，和
iii)第五锚，所述第五锚可选地与所述第一锚大致相同，并且可选地包括多聚A序列。


10.根据权利要求5至9中任一项所述的方法，进一步包括：
f)使所述第一样品和所述第二样品以及可选地另外的样品与包括第六配体的第六构建体接触，其中所述第六配体与第六靶标特异性结合，并且与第六寡核苷酸连接，所述第六寡核苷酸包括：
i)第六扩增柄，所述第六扩增柄可选地与所述第三扩增柄大致相同，
ii)第六条形码，其特异性识别所述第六靶标，和
iii)第六锚，所述第六锚可选地与所述第三锚相同，并且可选地包括多聚A序列。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一样品和所述第二样品，以及可选地一个或多个另外的样品，包括一个或多个细胞，并且所述第一、第二、第三、第四、第五和第六靶标存在于所述一个或多个细胞中的至少一个中或其表面上。


12.根据权利要求11所述的方法，其中(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的所述接触包括使所述第一样品、所述第二样品和可选的另外的样品的所述一个或多个细胞与所述第一、第二、第三、第四、第五或第六构建体接触。


13.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一样品和所述第二样品，以及可选地一个或多个另外的样品，包括一个或多个细胞器、线粒体、外来体、脂质体、合成或天然存在的囊泡、微囊泡、外体、细胞核、细菌、病毒、珠、颗粒、微粒、纳米颗粒、大分子以及合成或天然存在的脂质、磷脂或膜球，并且所述第一、第二、第三、第四、第五和第六靶标存在于所述一个或多个细胞器、线粒体、外来体、脂质体、合成或天然存在的囊泡、微囊泡、外体、细胞核、细菌、病毒、珠、颗粒、微粒、纳米颗粒、大分子以及合成或天然存在的脂质、磷脂或膜球中的至少一个中或其表面上。


14.根据权利要求13所述的方法，其中(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的所述接触包括使所述第一样品、所述第二样品和可选的另外的样品的所述一个或多个细胞器、线粒体、外来体、脂质体、合成或天然存在的囊泡、微囊泡、外体、细胞核、细菌、病毒、珠、颗粒、微粒、纳米颗粒、大分子以及合成或天然存在的脂质、磷脂或膜球与所述第一、第二、第三、第四、第五或第六构建体接触。


15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中(a)和(b)以及可选地(e)的所述接触在(c)、(d)或(f)中任一个的所述接触之前进行。


16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中(c)、(d)或(f)的所述接触包括使所述第一样品、所述第二样品和可选地另外的样品的混合物与所述第三、第四或第六构建体接触。


17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述第一、第二、第三、第四、第五或第六配体包括抗体或其抗原结合片段。


18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中(i)所述第一、第二、第三、第四、第五或第六锚分别位于所述第一、第二、第三、第四、第五或第六扩增柄的3'，且分别位于所述第一、第二、第三、第四、第五或第六条形码的3'；并且可选地，(ii)所述第一、第二、第三、第四、第五或第六扩增柄分别位于所述第一、第二、第三、第四、第五或第六条形码的5'，且分别位于所述第一、第二、第三、第四、第五或第六锚的5'。


19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，进一步包括在步骤(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的任何一个或多个之后洗涤所述第一样品、所述第二样品或所述第一样品和所述第二样品以及可选地另外的样品的混合物，以去除未结合的构建体。


20.根据权利要求11、12、15至19中任一项所述的方法，进一步包括在(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)之后，将所述第一、第二或第三样品中的一个的第一单细胞封装在第一液滴中，所述第一液滴包括与多个第一捕获寡核苷酸缀合的第一珠，所述第一捕获寡核苷酸从5'至3'包括第七扩增柄、识别所述第一珠的第七条形码和与所述第一、第二、第三、第四、第五或第六锚序列互补的序列，并且可选地将所述第一、第二或第三样品中的一个的第二单细胞封装在第二液滴中，所述第二液滴包括与多个第二捕获寡核苷酸缀合的第二珠，所述第二捕获寡核苷酸从5'至3'包括所述第七扩增柄、识别所述第二珠的第八条形码和与所述第一、第二、第三、第四、第五或第六锚序列互补的序列。


21.根据权利要求20所述的方法，进一步包括，使所述第一单细胞和所述第二单细胞裂解，从而提供封装在所述第一液滴中的第一裂解物和封装在所述第二液滴中的第二裂解物，其中所述第一裂解物和所述第二裂解物可选地包括mRNA。


22.根据权利要求20或21所述的方法，进一步包括使所述第一细胞和所述第二细胞的所述裂解物与聚合酶接触。


23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，进一步包括产生所述第一、第二、第三、第四、第五或第六寡核苷酸的cDNA和双链寡核苷酸序列。


24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，进一步包括扩增或检测所述第一、第二、第三、第四、第五或第六条形码序列。


25.根据权利要求24所述的方法，其中所述扩增或检测包括确定所述第一、第二和第三样品的存在、量或不存在，以及可选地，确定所述第一、第二、第三、第四、第五或第六靶标的存在、量或不存在。


26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述第一、第二、第三、第四、第五或第六寡核苷酸或者所述第一或第二捕获寡核苷酸包括UMI。


27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述第一、第二、第三、第四、第五和第六锚大致相同并且可选地包括多聚A序...

【专利技术属性】
技术研发人员：马龙·斯托基斯，皮特·斯密博特，布莱恩·侯克卢米斯，
申请(专利权)人：纽约基因组研究中心公司，
类型：发明
国别省市：美国;US