一种人X染色体着丝粒探针及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种人X染色体着丝粒探针及其制备方法，属于X染色体检测技术领域。本发明专利技术中的人X染色体着丝粒探针是针对人类X染色体着丝粒区的高度重复序列所设计，其对于人类的X染色体着丝粒具有较好的识别效果，检测准确率高，并且荧光信号特异性好、亮度强。本发明专利技术中采用巢式PCR探针标记法制备探针，使用荧光素标记的dUTP代替部分的dNTP，获得的探针即带有荧光素，可直接使用；探针得率高，方法简单，无需纯化，可以现标现用。

A centromere probe of human X chromosome and its preparation

The invention relates to a human X chromosome centromere probe and a preparation method thereof, belonging to the technical field of X chromosome detection. The human X-chromosome centromere probe in the invention is designed for the highly repetitive sequence of the human X-chromosome centromere region, which has good recognition effect for the human X-chromosome centromere, high detection accuracy, good fluorescence signal specificity and strong brightness. In the invention, a nested PCR probe labeling method is used to prepare a probe, and a fluorescein labeled dUTP is used to replace part of the dNTP, and the obtained probe is provided with fluorescein, which can be used directly; the yield of the probe is high, the method is simple, does not need purification, and can be used now.

【技术实现步骤摘要】
一种人X染色体着丝粒探针及其制备方法
本专利技术涉及一种人X染色体着丝粒探针及其制备方法，属于X染色体检测

技术介绍
X染色体是人类的性染色体，X性染色体的数目异常会使人产生性染色体病，性染色体病会使人性腺发育不全或两性畸形。如Klinefelter综合征患者的染色体核型为47，XXY，以身材高、睾丸小、第二性征发育不良、不育为特征。多X综合征，即XXX女性；约30％患者的卵巢功能低下，原发或继发闭经，过早绝经，乳房发育不良；1/3患者可伴先天畸形，如先天性心脏病、髋脱位；部分可有精神缺陷；X染色体越多，智力发育越迟缓，畸形亦越多见。Turner综合征，也称为女性先天性性腺发育不全或先天性卵巢发育不全综合征，其核型为45，X；患者以性发育幼稚、身材矮小(120～140cm左右)、肘外翻为特征，性腺为纤维条索状，无滤泡、子宫，外生殖器及乳房幼稚型。由于X染色体的数目异常会使人产生较为严重的疾病，因此X染色体数目的检测非常必要。目前，对于性染色体(X/Y染色体)荧光原位杂交检测所使用的探针，多为采用BAC克隆切口平移法标记或标记多条寡核苷酸法。BAC克隆切口平移法，其前期要进行菌体活化、摇菌、BAC克隆提取等复杂的准备工作；标记多条寡核苷酸法，需要对着丝粒特异性较高的多条寡核苷酸分别标记且效率低下。因此，采用BAC克隆切口平移法标记和标记多条寡核苷酸法费时、费力且效率低下。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人X染色体着丝粒探针，其对于人类的X染色体具有较好的检测效果。本专利技术还提供了上述人X染色体着丝粒探针的制备方法，探针得率高，方法简单，无需纯化。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种人X染色体着丝粒探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术中的人X染色体着丝粒探针是针对人类X染色体着丝粒区的高度重复序列所设计，其对于人类的X染色体着丝粒具有较好的识别效果。上述的人X染色体着丝粒探针的制备方法，采用巢式PCR方法制得，包括以下步骤：1)以人基因组DNA为模板，使用引物ChrX-1-F和ChrX-1-R进行首轮PCR反应；2)然后以首轮PCR产物稀释液作为模板，使用引物ChrX-2-F和ChrX-2-R进行第二轮PCR反应，即得；所用引物序列如下所示：ChrX-1-F：5’-CAATGCTTCTCTCTCGTCT-3’(如SEQIDNO.2所示)；ChrX-1-R：5’-GGTGGATATTTGGACCTCTC-3’(如SEQIDNO.3所示)；ChrX-2-F：5’-ATCAAAAGGAGGGTTCAACTG-3’(如SEQIDNO.4所示)；ChrX-2-R：5’-CTCTCTGAGGATTTCGTTGG-3’(如SEQIDNO.5所示)。本专利技术中采用巢式PCR探针标记法制备探针，探针得率高，方法简单，无需纯化，可以现标现用。为提高PCR扩增的准确度和效率，优选的，所述首轮PCR反应和第二轮PCR反应采用TouchdownPCR反应程序。更为具体的，所述TouchdownPCR反应程序为：1)预变性94℃，2min；2)变性94℃，20s；退火65℃，15s；延伸68℃，15s；每个循环退火温度降低0.5℃，10个循环后退火温度降低至60℃；3)然后变性94℃，15s；退火60℃，15s；延伸72℃，10s；进行25个循环；4)72℃延伸2min。优选的，在PCR扩增时，即进行标记颜色。优选的，所述首轮PCR反应和第二轮PCR反应的反应体系包括dNTP；所述dNTP为dATP、dTTP、dGTP、dCTP和dUTP；所述dUTP由荧光素标记。dUTP能够替代部分的dTTP插入在PCR扩增探针中，而dUTP带有颜色标记，因此所获得的PCR探针也带有颜色，在FISH杂交时，可直接使用，其能与X染色体着丝粒杂交，并显出颜色。若dUTP过多将严重阻滞PCR进程，导致PCR产物得率较低；若dUTP过少则探针荧光素含量较低，信号亮度较弱。因此优选的，所述dTTP与dUTP的摩尔比为0.8-1.2：0.8-1.2。更为优选的，所述dTTP与dUTP的摩尔比为1：1。优选的，所述dATP、dTTP、dGTP、dCTP和dUTP的摩尔比为1.6-2.4：0.8-1.2：1.6-2.4：1.6-2.4：0.8-1.2。更为优选的，所述dATP、dTTP、dGTP、dCTP和dUTP的摩尔比为2：1：2：2：1。模板量过大则易造成非特异性扩增；模板量过少则产物浓度低。因此优选的，所述首轮PCR反应和第二轮PCR反应中模板的浓度为8-12ng。附图说明图1为本专利技术试验例1中探针对于细胞中的X染色体进行检测结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。以下实施例及试验例中所使用的10×PCRBuffer、25mMMgCl2、DNATaq聚合酶购自上海生工生物；dATP、dTTP、dGTP、dCTP购自Takara；荧光素dUTP-R购自江苏普诺生，其上标记由荧光素，显出红色；封闭剂Cot-1DNA购自Invitrogen，货号1996778；杂交缓冲液配方为杂交缓冲液配方为30％甲酰胺，28％硫酸葡聚糖，8.75g/L氯化钠，4.4g/L柠檬酸钠。人X染色体着丝粒探针的实施例1本实施例中人X染色体着丝粒探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。人X染色体着丝粒探针的制备方法的实施例1本实施例中人X染色体着丝粒探针采用巢式PCR方法制得，包括如下步骤：1)以人基因组DNA为模板，使用引物ChrX-1-F和ChrX-1-R进行首轮PCR反应；所用引物序列如下所示：ChrX-1-F：5’-CAATGCTTCTCTCTCGTCT-3’；ChrX-1-R：5’-GGTGGATATTTGGACCTCTC-3’；2)然后以首轮PCR产物1000倍稀释液作为模板，使用引物ChrX-2-F和ChrX-2-R进行第二轮PCR反应，即得；所用引物序列如下所示：ChrX-2-F：5’-ATCAAAAGGAGGGTTCAACTG-3’；ChrX-2-R：5’-CTCTCTGAGGATTTCGTTGG-3’。首次及二次PCR反应程序都采用TouchdownPCR法。PCR反应体系(20μL)为：1、10×PCRBuffer：2.0μL；2、25mMMgCl2：1.2μL；3、引物1：1.5μL；4、引物2：1.5μL；5、PCR模板：10ng；6、AGCT(1：1：1：0.65)：4.0μL；7、dUTP-R：0.87μL；8、DNATaq聚合酶：0.23μL；9、无核酸水：补足20μL。TouchdownPCR反应程序：预变性94℃，2mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人X染色体着丝粒探针，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种人X染色体着丝粒探针，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.如权利要求1所述的人X染色体着丝粒探针的制备方法，其特征在于：采用巢式PCR方法制得，包括以下步骤：
1）以人基因组DNA为模板，使用引物ChrX-1-F和ChrX-1-R进行首轮PCR反应；
2）然后以首轮PCR产物稀释液作为模板，使用引物ChrX-2-F和ChrX-2-R进行第二轮PCR反应，即得；
所用引物序列如下所示：
ChrX-1-F：5’-CAATGCTTCTCTCTCGTCT-3’；
ChrX-1-R：5’-GGTGGATATTTGGACCTCTC-3’；
ChrX-2-F：5’-ATCAAAAGGAGGGTTCAACTG-3’；
ChrX-2-R：5’-CTCTCTGAGGATTTCGTTGG-3’。


3.根据权利要求2所述的人X染色体着丝粒探针的制备方法，其特征在于：所述首轮PCR反应和第二轮PCR反应采用TouchdownPCR反应程序。


4.根据权利要求3所述的人X染色体着丝粒探针的制备方法，其特征在于：所述TouchdownPCR反应程序为：

【专利技术属性】
技术研发人员：李三华，李贵喜，刘玲玲，李艳敏，胡娟，齐华，刘文弟，
申请(专利权)人：河南赛诺特生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41