一种一抗后试剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种一抗后试剂及其制备方法和应用

【技术实现步骤摘要】
一种一抗后试剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种一抗后试剂及其制备方法和应用，属于生物学检测
及免疫学

。

技术介绍

[0002]免疫组织化学
(Immunohistochemistry
，
IHC)
是指通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位对病理组织中相应抗原显色进行定性
、
定位或定量测定的一项免疫学检测技术
。
[0003]免疫组织化学
(
免疫组化
)
实验过程起始于组织玻片的前处理，一抗孵育，二抗的滴加，
DAB
显色，终止于苏木素复染，最后在镜下进行观察和作出判断
。
其中，免疫组化二抗检测系统，又称“免疫组化一抗诊断试剂信号显示和放大系统”，它在一抗单克隆抗体特异性抗原
‑
抗体反应后使用，起着特异
、
敏感和稳定的信号显示和放大的作用，是免疫组化能否取得良好结果的重要一环
。
传统的免疫组化二抗检测系统是组织细胞中的抗原与一抗相结合，二抗再与一抗相结合，通过显色液对二抗上的标记物进行显色，达到微观可见
。
随着人们对免疫组化检测灵敏度和特异性要求的提高，以及对一些表达丰度低的蛋白检测的需求量增加，逐渐开发出二步法检测系统
。
二步法检测系统与传统的免疫组化二抗检测系统相比，增加了一抗后试剂，组织细胞中的抗原与一抗相结合后，一抗后试剂先与一抗相结合，二抗再与一抗后试剂相结合进行显色
。
二步法检测系统由于具有背景低
、
操作简便，增强了抗体的特异性，提高抗体的稀释比，节约了成本等优点，近几年被广泛应用
。
[0004]目前，在国内市场，罗氏诊断，徕卡病理，安捷伦
‑
DAKO
等国际巨头通过将全自动
IHC
染色仪与自主研发的二抗检测系统试剂
(
包括一抗后试剂和二抗试剂等
)
绑定，形成闭环模式，垄断了
85
％左右的市场份额，获取了高额利润
。
由于国内相关产业链的薄弱和此项技术的欠缺，国产免疫组化品牌迈新
、
中杉等以进口原料和分装试剂为主
。
而且，目前市场上存在的一抗后试剂针对低丰度蛋白
(
低表达蛋白
)
的第一抗体的结合活性参差不齐，检测灵敏度和特异性均相对不高
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种一抗后试剂的制备方法，以解决现有技术中一抗后试剂检测的灵敏度和特异性相对较低的问题
。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供一种一抗后试剂，以解决现有技术中一抗后试剂针对低表达蛋白的第一抗体的结合活性参差不齐，检测灵敏度和特异性均相对不高的问题
。
[0007]本专利技术的第三个目的是提供一抗后试剂在免疫组化低表达蛋白检测中应用，以解决现有技术中低表达蛋白检测的灵敏度和特异性相对较低的问题
。
[0008]本专利技术的第四个目的是提供一抗后试剂在制备免疫组化检测试剂和
/
或检测试剂盒中的应用，以解决现有技术中低表达蛋白检测的灵敏度和特异性相对较低的问题
。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术中一抗后试剂的制备方法的技术方案是：
[0010]一种一抗后试剂的制备方法，包括如下步骤：
[0011](1)
将含有抗鼠
IgG
抗体的血清通过
proteinA/G
纯化填料柱初步纯化，收集第一洗脱液；
[0012](2)
步骤
(1)
所述的第一洗脱液经人
IgG
‑
鼠
IgG
串联纯化柱亲和纯化，洗脱鼠
IgG
纯化柱并收集第二洗脱液；
[0013](3)
步骤
(2)
所述的第二洗脱液经阴离子交换柱纯化，收集流穿液；
[0014](4)
将步骤
(3)
所述的流穿液中溶剂置换获得一抗后试剂
。
[0015]上述技术方案的有益效果在于：与现有技术相比，本专利技术一抗后试剂的制备方法中增加了
proteinA/G
填料纯化和阴离子交换纯化，而且抗体亲和纯化阶段将用于去除交叉的人
IgG
亲和纯化柱与用于亲和反应的鼠
IgG
亲和柱串联，减少抗体的纯化步骤，进而减少抗体经多步纯化致使抗体活性受损，进一步提高抗体的特异性和灵敏度
。
经实验验证，增加了一抗后试剂的特异性和灵敏度
。
而且本专利技术的方法步骤简单，适合大规模生产获得大量的一抗后试剂
。
[0016]作为进一步地改进，步骤
(1)
中所述含有抗鼠
IgG
抗体的血清为含有抗鼠
IgG
抗体的兔血清
。
[0017]上述技术方案的有益效果在于：本专利技术通过纯化方式和具体纯化步骤的选择优化，开发出一套适合含有抗鼠
IgG
抗体的兔血清的纯化过程
。
兔相比山羊，具有价格低
、
生长周期短
、
易于饲养的优点，能显著降低一抗后试剂的生产成本
。
[0018]作为进一步地改进，步骤
(1)(2)
包括第一洗脱液和第二洗脱液的中和；所述中和为加入
pH
为8～
8.5、
浓度为
0.1
～
0.2M
的
Tris
缓冲液
。
[0019]上述技术方案的有益效果在于：将
Tris
缓冲液快速加入洗脱液中并混匀，达到调整洗脱液
pH
值至
pH7.2
～
7.5
，减少抗体活性受损
。
[0020]作为进一步地改进，步骤
(3)
中所述第二洗脱液中抗体的浓度为1～
1.5mg/mL。
[0021]上述技术方案的有益效果在于：将洗第二洗脱液中抗体的浓度调整1～
1.5mg/mL
范围内，再进行阴离子交换柱纯化，能有效地利用阴离子交换柱纯化去除杂质蛋白，提高一抗后试剂的抗体纯度
。
[0022]作为进一步地改进，步骤
(4)
中所述溶剂置换为流穿液经超滤将溶剂置换为
PBS
缓冲液或
TBS
缓冲液
。
具体地，所述置换还可以采用透析的方式
。
[0023]上述技术方案的有益效果在于：将流穿液的溶剂置换为...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种一抗后试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)
将含有抗鼠
IgG
抗体的血清通过
proteinA/G
纯化填料柱初步纯化，收集第一洗脱液；
(2)
步骤
(1)
所述的第一洗脱液经人
IgG
‑
鼠
IgG
串联纯化柱亲和纯化，洗脱鼠
IgG
纯化柱并收集第二洗脱液；
(3)
步骤
(2)
所述的第二洗脱液经阴离子交换柱纯化，收集流穿液；
(4)
将步骤
(3)
所述的流穿液中溶剂置换获得一抗后试剂
。2.
根据权利要求1所述的一抗后试剂的制备方法，其特征在于：步骤
(1)
中所述含有抗鼠
IgG
抗体的血清为含有抗鼠
IgG
抗体的兔血清
。3.
根据权利要求1所述的一抗后试剂的制备方法，其特征在于：步骤
(1)(2)
包括第一洗脱液和第二洗脱液的中和；所述中和为加入
pH
为8～
8.5、
浓度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：王远丽，陈明涛，翟晋豫，曹晓菲，常秋霜，王迎丽，何梦晓，齐华，
申请(专利权)人：河南赛诺特生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：