一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法及应用，该方法包括如下步骤：S1，sgRNA文库设计；S2，制备CRISPR/Cas9载体文库；S3，遗传转化；S4，sgRNA鉴定；S5，检测基因编辑苗；本发明专利技术采用CRISPR/Cas9技术，一次性获得整个水稻多基因编辑突变体库，相比于现有的逐个基因敲除，效率提高，同时显著的减少工作量；同时本发明专利技术设计了一个完整、系统、高效的植物多基因组编辑和检测方法，可以高效、低成本的对大量通路基因或基因家族进行精准编辑和编辑苗的检测分析，为CRISPR/Cas9技术在植物信号通路研究或基因家族功能研究和筛选带来了帮助和参考意义。

【技术实现步骤摘要】
一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法及应用。
技术介绍
CRISPR/Cas9系统是在多数细菌和古生菌中存在的一种获得性免疫系统，CRISPR由一系列短的高度保守的正向重复序列与长度相似的间隔序列组成。Cas基因是一类由基因家族，编码的蛋白质具有与核酸结合的功能以及与核酸酶、聚合酶、解旋酶等结合的活性，CRISPR/Cas9系统具有一系列的Cas基因，这些基因在宿主应对外源遗传物质入侵时发挥着不同的作用，而且在不同的物种中，Cas基因的种类也各不相同，具有丰富的多样性，会表达出多种同源但功能并不相关的Cas蛋白。CRISPR/Cas9技术作为第三代人工核酸内切酶技术，是Cas系统中最简单的，主要由编码Cas蛋白的基因、一个短的前导区以及一个由间隔序列和重复序列构成的CRISPR得基因座构成。前导区是由一段富含AT碱基的非编码序列构成，作为CRISPR启动基因发挥作用。虽然其作用机理现在还无法完全解释清楚，但是其作用过程可以分为三个阶段来理解，第一是CRISPR高度可变的间隔区的获得，第二是CRISPR基因座的表达，第三是CRISPR/Cas9系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰。创建不同动植物的突变体库，对于高通量的研究基因功能和创制种质资源十分重要。目前，基于CRISPR/Cas9技术已经在动植物中实现了高通量大规模的基因组编辑，可以实现对几万甚至十几万个基因位点进行定点的敲除，这可以高效的快速研究基因功能。但是，在创建植物突变库的过程中，在鉴定不同突变个体时，目前依然还是使用的是一代测序技术(Sanger测序)，成本极高，而且无法获得突变体的精准的突变类型。另一方面，为了研究某一类基因家族或相关的通路基因，需要对该基因家族和相关通路基因进行敲除，建立一个小型的突变体文库，但是目前少有相关的详细的技术资料。因此，本专利技术拟开发一个完整的系统的构建水稻多基因突变体文库的方法，并且该方法可以高效低成本的获得大批量的基因编辑苗和检测基因编辑苗突变类型。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法及应用。基于本专利技术中一种完整的系统的构建水稻多基因突变体文库的方法，实现了高效低成本的获得大批量的基因编辑苗和检测基因编辑苗突变类型的目的。本专利技术的一个目的在于提供一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法。所述构建水稻多基因编辑突变体库的方法，包括如下步骤：S1，sgRNA文库设计：根据水稻基因组序列，针对水稻不同的功能基因设计特异性的sgRNA序列，然后加入一段与CRISPR/Cas9载体粘性末端互补的序列，制得sgRNA文库；S2，制备CRISPR/Cas9载体文库：将步骤S1制得的sgRNA整合到CRISPR/Cas9载体上，送高通量测序验证构建正确后，形成CRISPR/Cas9载体文库；S3，遗传转化：将步骤S2中制得的CRISPR/Cas9载体转化农杆菌，经筛选鉴定、培养后得到菌悬液，然后将上述菌悬液转化水稻愈伤组织，经真核抗性筛选，获得转基因阳性植株；S4，sgRNA鉴定：对步骤S3中获得的阳性苗进行载体骨架片段的测序分析，进行sgRNA鉴定，确定每株苗所对应的sgRNA种类；S5，检测基因编辑苗：基于步骤S4中确定的阳性苗的sgRNA序列信息，批量化设计检测引物，对阳性苗进行PCR扩增和测序分析，最后获得详细的基因编辑类型和结果。进一步地，步骤S1中，所述sgRNA序列的GC含量在40～80％之间，靶标尽量处在第一外显子上，并与潜在脱靶位点至少存在3个碱基的区别，且不容许有4个连续T碱基；所述sgRNA序列两端加上与CRISPR/Cas9载体经BsaⅠ酶酶切后形成的4个碱基粘性末端互补的序列，加上互补序列后，正向引物序列为：5’-TGCA-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’，反向引物序列：5’-AAAC-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’，N代表任意碱基，且为设计的特异性sgRNA序列。进一步地，步骤S2中，所述CRISPR/Cas9载体文库构建过程中，采用的基因编辑载体为双元载体，所述双元载体包含有sgRNA表达框和Cas9表达框；并且所述CRISPR/Cas9载体文库中的每个质粒只表达1个sgRNA。进一步地，步骤S2中，首先采用BsaⅠ酶对所述CRISPR/Cas9载体进行酶切，然后与步骤S1中sgRNA文库混合，加入T4连接酶进行酶连，最后转化大肠杆菌，经抗性筛选鉴定、得到阳性克隆，将所述阳性克隆经过大量培养、质粒抽提等步骤，获得质粒文库。更进一步地，将所述质粒文库中的质粒，依据载体骨架序列，设计检测引物，所述检测引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，然后利用上述检测引物扩增包含sgRNA区间的序列，并且扩增产物大小控制在180～260bp之间；将上述扩增产物，送高通量测序，检测CRISPR/Cas9载体文库覆盖度。进一步地，步骤S3中，所述质粒载体转化农杆菌的方法为化学转化法或电击转化法，所述农杆菌菌悬液的浓度为OD600：0.1～0.5。进一步地，步骤S4中，首先提取步骤S3中获得的阳性苗基因组，使用如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的序列，扩增包含sgRNA区间的序列，并且扩增产物大小控制在180～260bp之间；将上述扩增产物，送高通量测序，检测每株苗的sgRNA覆盖情况。进一步地，步骤S5中，基于引物设计软件Primer3，使用PREL语言，批量化设计每个sgRNA的检测引物，扩增的目的片段大小在180～260bp之间，所述检测引物TM值范围为：50～62℃，最优选的TM值是58℃，所述检测引物长度范围为：18～25bp，最优选的长度为20bp，所述检测引物GC含量范围为：40～68％，最优选的引物GC含量为50％；然后利用多重PCR扩增技术，在目的片段加上barcode序列和测序接头，送高通量测序，检测每颗阳性苗的基因编辑突变情况。本专利技术的另外一个目的在于提供一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法在构建日本晴多基因编辑突变体库中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：1)本专利技术采用CRISPR/Cas9技术，一次性获得整个水稻多基因编辑突变体库，相比于现有的逐个基因敲除，效率提高，同时显著的减少工作量；2)本专利技术利用高通量的检测方法对阳性日本晴植株进行检测，当sgRNA混合个数为8个时，检测到敲除基因为7个，编辑效率为87.5％；当sgRNA混合个数为100个时，检测到敲除基因为67个，编辑效率为67％；当sgRNA混合个数为200个时，检测到敲除基因为121个，编辑效率为60.5％；3)本专利技术设计了一个完整、系统、高效的植物多基因组编辑和检测方法，可以高效、低成本的对大量通路基因或基因家族进行精准编辑和编辑苗的检测分析，为CRISPR/Cas9技术在植物信号本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1，sgRNA文库设计：根据水稻基因组序列，针对水稻不同的功能基因设计特异性的sgRNA序列，然后加入一段与CRISPR/Cas9载体粘性末端互补的序列，制得sgRNA文库；/nS2，制备CRISPR/Cas9载体文库：将步骤S1制得的sgRNA整合到CRISPR/Cas9载体上，送高通量测序验证构建正确后，形成CRISPR/Cas9载体文库；/nS3，遗传转化：将步骤S2中制得的CRISPR/Cas9载体转化农杆菌，经筛选鉴定、培养后得到菌悬液，然后将上述菌悬液转化水稻愈伤组织，经真核抗性筛选，获得转基因阳性植株；/nS4，sgRNA鉴定：对步骤S3中获得的阳性苗进行载体骨架片段的测序分析，进行sgRNA鉴定，确定每株苗所对应的sgRNA种类；/nS5，检测基因编辑苗：基于步骤S4中确定的阳性苗的sgRNA序列信息，批量化设计检测引物，对阳性苗进行PCR扩增和测序分析，最后获得详细的基因编辑类型和结果。/n

【技术特征摘要】
1.一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，sgRNA文库设计：根据水稻基因组序列，针对水稻不同的功能基因设计特异性的sgRNA序列，然后加入一段与CRISPR/Cas9载体粘性末端互补的序列，制得sgRNA文库；
S2，制备CRISPR/Cas9载体文库：将步骤S1制得的sgRNA整合到CRISPR/Cas9载体上，送高通量测序验证构建正确后，形成CRISPR/Cas9载体文库；
S3，遗传转化：将步骤S2中制得的CRISPR/Cas9载体转化农杆菌，经筛选鉴定、培养后得到菌悬液，然后将上述菌悬液转化水稻愈伤组织，经真核抗性筛选，获得转基因阳性植株；
S4，sgRNA鉴定：对步骤S3中获得的阳性苗进行载体骨架片段的测序分析，进行sgRNA鉴定，确定每株苗所对应的sgRNA种类；
S5，检测基因编辑苗：基于步骤S4中确定的阳性苗的sgRNA序列信息，批量化设计检测引物，对阳性苗进行PCR扩增和测序分析，最后获得详细的基因编辑类型和结果。


2.如权利要求1所述的构建水稻多基因编辑突变体库的方法，其特征在于，步骤S1中，所述sgRNA序列的GC含量在40～80％之间，靶标尽量处在第一外显子上，并与潜在脱靶位点至少存在3个碱基的区别，且不容许有4个连续T碱基；所述sgRNA序列两端加上与CRISPR/Cas9载体经BsaⅠ酶酶切后形成的4个碱基粘性末端互补的序列，加上互补序列后，
正向引物序列为：5’-TGCA-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’，
反向引物序列：5’-AAAC-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’，N代表任意碱基，且为设计的特异性sgRNA序列。


3.如权利要求1所述的构建水稻多基因编辑突变体库的方法，其特征在于，步骤S2中，所述CRISPR/Cas9载体文库构建过程中，采用的基因编辑载体为双元载体，所述双元载体包含有sgRNA表达框和Cas9表达框；并且所述CRISPR/Cas9载体文库中的每个质粒只表达1个sgRNA。


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【专利技术属性】
技术研发人员：吴磊，李阳，董梦洁，
申请(专利权)人：湖北伯远合成生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42