一种用于大片段DNA无缝组装的系统及组装方法技术方案

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于大片段DNA无缝组装的系统及组装方法，所述组装方法包括：S1、构建载体系统；S2、目标片段克隆：将大片段DNA分成多个目标片段，并将目标片段按顺序交替克隆到供给载体D1、D2上；S3、连续组装：用EN1同时酶切接受载体A和酶切供给载体D1‑seg1，通过组装反应得到pBWRA‑seg1，然后采用EN2酶切pBWRA‑seg1和供给载体D2‑seg2，通过组装反应得到pBWRA‑seg1‑seg2；S4、重复步骤S3，根据确定的组装顺序将目标片段分步组装连接到接受载体A上，形成最终所需要的载体。本发明专利技术通过人工设计的RNA介导的LbCas12a核酸内切酶能够支持更大片段的连接，在含有多个基因的转基因载体构建、合成生物学、代谢通路研究等方面具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种用于大片段DNA无缝组装的系统及组装方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种用于大片段DNA无缝组装的系统及组装方法。
技术介绍
DNA组装技术是合成生物学实现各种目标的重要环节及关键步骤。短DNA片段可以很容易通过PCR介导的合成方法获得，但是克隆大于10kb的DNA片段仍然面临较大挑战，首先大片段高保真扩增的能力有限，PCR介导的合成方法错误率比较高，尤其对于合成大于10kb以上的DNA，而且大片段的突变率在PCR扩增过程中也会随之增加，为了得到正确的克隆，需要进行多次克隆和测序的重复工作，甚至需要进行回复突变等操作，导致成本大幅增加，且需要花费大量的时间和精力。因此，迫切需要简单、高效和快捷的基因组DNA组装技术。随着合成生物学技术的进步，尤其是IIs型限制性内切酶的使用让更大规模的组装得以实现。研究人员先后开发出了具有代表性的GoldenGate和GibsonAssembly等由小片段组装而成大片段的体外组装技术。GoldenGate利用IIs型限制性内切酶切出在其识别序列的外侧进行切割，产生所需的黏性末端，一次进行多个片段的无缝连接，但是现有的IIs型限制性内切酶识别的最长碱基数为7bp，如AarI和SapI，平均47/2＝8192bp就会至少存在一个酶切位点，难以支持更大片段的连接，一旦遇到超过10kb的超大片段一般就不能用GoldenGate构建。本实验室前期基于GoldenGate原理建立的一种多片段DNA分子组装方法及应用(BioWalk1.0系统)、专利号：ZL201310094572.6就遇到这样的问题，若需要继续组装就必须通过密码子优化掉该酶切位点，但随着组装的载体越来越大，例如一些启动子含有较多操作的酶切位点，就很难再继续组装下去。为克服内切酶产生黏性末端基数不足的缺陷，Gibson等放弃限制性内切酶，采用5’核酸外切酶，联合DNA聚合酶以及DNA连接酶，建立了的不受酶切位点限制的重组技术，但是同时重组超过5个片段就会导致重组效率显著降低，而且重组好的大片段载体若要继续修改就会由于没有合适的单一酶切位点切割而无法继续组装。随着功能基因组学等研究的深入，数十个基因相互协调的研究已经越来越广泛，而几个基因进行转化已不能胜任。因此，将数十个基因构建在同一个载体上并且进行一次性转化的技术将非常必要。目前虽然有一些大片段的多基因组装系统，但是操作相对较复杂，且不能实现无缝连续组装。开发一种适用于多个大片段的无缝DNA组装方法就显得尤为重要。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种用于大片段DNA无缝组装的系统及组装方法，通过人工设计的RNA介导的LbCas12a核酸内切酶能够支持更大片段的连接，适用于大片段DNA分段无缝组装成一个更大的完整片段，在含有多个基因的转基因载体构建、合成生物学、代谢通路研究等方面具有良好的应用前景。本专利技术的目的一在于提供：一种用于大片段DNA无缝组装的系统，包括由接受载体A(pBWRA)、供给载体D1(pBWRD1)和供给载体D2(pBWRD2)组成的系统；所述接受载体A的多克隆位点中含有一组核酸内切酶识别靶位点EN1，且按照：“载体骨架---反向EN1靶位点---任意碱基---同源臂13R---正向EN1靶位点---载体骨架”排列，所述接受载体A的载体骨架中不含有EN1靶位点；所述供给载体D1的多克隆位点中含有三组核酸内切酶识别靶位点，且从上游到下游按照：“载体骨架---正向EN1靶位点---反向EN3靶位点---任意碱基---正向EN3靶位点---反向EN2靶位点---任意碱基---正向EN2靶位点---同源臂13R---反向EN1靶位点---载体骨架”排列，所述供给载体D1的载体骨架中不含有EN1、EN2、EN3靶位点；所述供给载体D2的多克隆位点中含有三组核酸内切酶识别靶位点，且从上游到下游按照：“载体骨架---正向EN2靶位点---反向EN3靶位点---任意碱基---正向EN3靶位点---反向EN1靶位点---任意碱基---正向EN1靶位点---同源臂13R---反向EN2靶位点---载体骨架”排列，所述供给载体D2的载体骨架中不含有EN1、EN2、EN3靶位点；所述核酸内切酶为识别位点和酶切位点不完全重复的DNA内切酶。进一步的，所述核酸内切酶的正向识别靶位点的酶切位点在识别靶位点的下游，反向识别靶位点的酶切位点在识别靶位点的上游。进一步的，所述核酸内切酶为RNA介导的LbCas12a核酸内切酶。所述LbCas12a核酸内切酶的crRNA分别为crRNA1、crRNA2、crRNA3；通过人工将crRNA1、crRNA2、crRNA3与LbCas12a蛋白融合，形成三种LbCas12a核酸内切酶，分别靶向对应的EN1、EN2、EN3靶位点；通过人工设计crRNA，其识别靶位点的序列长度可控，优选大于7bp，也可以是8bp或更长、9bp或更长、12bp或更长等；LbCas12a核酸内切酶识别的靶位点序列越长，目标大片段中存在2个或更多个该靶位点的概率越低，即酶切位点重复出现的概率越小，因此便于寻找合适的单一酶切位点，实现大片段的连续组装。进一步的，所述核酸内切酶的识别靶位点长度大于等于12bp。进一步的，所述EN1、EN2和EN3靶位点中含有限制性内切酶的酶切位点，所述EN1、EN2和EN3EN1中限制性内切酶的酶切位点不同，且所述载体骨架不含有EN1、EN2、EN3靶位点以及该限制性内切酶的酶切位点。进一步的，所述限制性内切酶为BsmBI、SapI和BsaI。例如：所述EN1靶位点含有BsmBI的酶切位点，所述EN2靶位点含有SapI的酶切位点，所述EN3靶位点含有BsaI的酶切位点。采用上述的技术方案：在构建目的片段时可以根据实际情况选用酶切连接还是同源重组，以及是选用EN3酶切供给载体还是BsaI酶切供给载体，例如，供给载体D1在组装大片段seg1时，若seg1片段不含有BsaI的酶切位点，则seg1可以采用BsaI酶切，T4DNAligase连接的方法构建；或者供给载体D1采用BsaI酶切，seg1采用同源重组克隆到供给载体D1，供给载体D1也可以采用EN3酶切；大大提高了系统的适用性。进一步的，所述供给载体D1和供给载体D2的反向EN3靶位点和正向EN3靶位点之间添加负筛选基因或颜色显示基因，负筛选基因如CCDB致死基因，颜色显示基因如GFP，RFP等荧光基因或者花青素，胡罗卜素等颜色合成基因，便于筛选阳性克隆子，避免目标片段克隆进入时供给载体D1和供给载体D2出现假阳性，提高目标片段克隆进入供给载体的效率。进一步的，所述接受载体A的反向EN1靶位点和正向EN1靶位点之间、所述供给载体D1的反向EN2靶位点和正向EN2靶位点之间以及所述供给载体D2的反向EN1靶位点和正向EN1靶位点之间添加颜色显示基因，颜色显示基因如GFP，RFP等荧光基因或者花青素，胡罗卜素等颜色合成基因，便于筛选。例如：所述接受本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于大片段DNA无缝组装的系统，其特征在于，包括由接受载体A、供给载体D1和供给载体D2组成的系统；/n所述接受载体A的多克隆位点中含有一组核酸内切酶识别靶位点EN1，且按照：“载体骨架---反向EN1靶位点---任意碱基---同源臂13R---正向EN1靶位点---载体骨架”排列，所述接受载体A的载体骨架中不含有EN1靶位点；/n所述供给载体D1的多克隆位点中含有三组核酸内切酶识别靶位点，且从上游到下游按照：“载体骨架---正向EN1靶位点---反向EN3靶位点---任意碱基---正向EN3靶位点---反向EN2靶位点---任意碱基---正向EN2靶位点---同源臂13R---反向EN1靶位点---载体骨架”排列，所述供给载体D1的载体骨架中不含有EN1、EN2、EN3靶位点；/n所述供给载体D2的多克隆位点中含有三组核酸内切酶识别靶位点，且从上游到下游按照：“载体骨架---正向EN2靶位点---反向EN3靶位点---任意碱基---正向EN3靶位点---反向EN1靶位点---任意碱基---正向EN1靶位点---同源臂13R---反向EN2靶位点---载体骨架”排列，所述供给载体D2的载体骨架中不含有EN1、EN2、EN3靶位点；/n所述核酸内切酶为识别位点和酶切位点不完全重复的DNA内切酶。/n...

【技术特征摘要】
20191231 CN 20191142062331.一种用于大片段DNA无缝组装的系统，其特征在于，包括由接受载体A、供给载体D1和供给载体D2组成的系统；
所述接受载体A的多克隆位点中含有一组核酸内切酶识别靶位点EN1，且按照：“载体骨架---反向EN1靶位点---任意碱基---同源臂13R---正向EN1靶位点---载体骨架”排列，所述接受载体A的载体骨架中不含有EN1靶位点；
所述供给载体D1的多克隆位点中含有三组核酸内切酶识别靶位点，且从上游到下游按照：“载体骨架---正向EN1靶位点---反向EN3靶位点---任意碱基---正向EN3靶位点---反向EN2靶位点---任意碱基---正向EN2靶位点---同源臂13R---反向EN1靶位点---载体骨架”排列，所述供给载体D1的载体骨架中不含有EN1、EN2、EN3靶位点；
所述供给载体D2的多克隆位点中含有三组核酸内切酶识别靶位点，且从上游到下游按照：“载体骨架---正向EN2靶位点---反向EN3靶位点---任意碱基---正向EN3靶位点---反向EN1靶位点---任意碱基---正向EN1靶位点---同源臂13R---反向EN2靶位点---载体骨架”排列，所述供给载体D2的载体骨架中不含有EN1、EN2、EN3靶位点；
所述核酸内切酶为识别位点和酶切位点不完全重复的DNA内切酶。


2.如权利要求1所述的用于大片段DNA无缝组装的系统，其特征在于，所述核酸内切酶的识别靶位点长度大于等于12bp。


3.如权利要求1所述的用于大片段DNA无缝组装的系统，其特征在于，所述核酸内切酶的正向识别靶位点的酶切位点在识别靶位点的下游，反向识别靶位点的酶切位点在识别靶位点的上游。


4.如权利要求3所述的用于大片段DNA无缝组装的系统，其特征在于，所述核酸内切酶为RNA介导的LbCas12a核酸内切酶。


5.如权利要求1所述的用于大片段DNA无缝组装的系统，其特征在于，所述EN1、EN2和EN3靶位点中含有限制性...

【专利技术属性】
技术研发人员：李阳，易良华，
申请(专利权)人：湖北伯远合成生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42