一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计及其检测方法技术

本发明专利技术属于农作物育种技术领域，公开了一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计及其检测方法。根据COLD1基因在籼、粳编码区SNP2的等位单核苷酸差别，粳型COLD1

Design and detection of a new functional marker of cold 1 gene in Rice

The invention belongs to the technical field of crop breeding, and discloses a design of a new functional marker of cold-resistant gene cold1 of rice and a detection method thereof. According to the difference of snp2 allele of cold 1 gene between Indica and japonica, cold 1 of Japonica type

【技术实现步骤摘要】
一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计及其检测方法
本专利技术属于农作物育种
，尤其涉及一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计及其检测方法。
技术介绍
在我国，水稻是最主要的农作物之一，分布也较为广阔，全国各省均有种植。依据植物学分类，我国种植的水稻品种属于亚洲栽培稻(OryzasativaL.)，包括粳稻(OryzasativaL.ssp.japonica)和籼稻(OryzasativaL.ssp.Indica)2个亚种，它们在形态、发育与生理等方面都表现出较大的差异。粳稻产量往往不及籼稻，但大都比籼稻具有更强的低温耐受性。尽管全球气候总体变暖，但不可否认，近年来极端气候频繁，如倒春寒和寒露风等低温灾害常有发生，导致水稻产量损失严重，特别是籼稻。利用粳稻耐低温基因导入籼稻，是改良提高籼稻抗寒性能的重要途径和方法，也是籼稻育种工作者的共识。借助现代分子生物学技术，人们对于粳稻普遍具有的低温耐受性有了一定的认识，但耐低温胁迫的遗传机理较为复杂，研究进展还是相对较为缓慢。据统计，在水稻中，虽然有数百个耐低温QTL被定位，然而，能够进行精细定位和克隆分析的基因少之又少。已进行精细定位的约12个，涉及到萌发期、苗期、孕穗期及成熟期等不同时期的低温耐受性。克隆且开展功能研究的耐低温基因约有8个，涉及Ctb1、GSTZ2、qLTG3-1、LTG1、COLD1、qCTS-9、CTB4a、bZIP73等。其中，COLD1编码一个定位于质膜和内质网上的G蛋白信号调节因子，其与G蛋白α亚基RGA1互作以感知低温，应答低温胁迫机制，激活Ca2+通道，以增强G蛋白GTP酶活性，从而提高水稻的耐寒性能。水稻粳型COLD1Jap较籼型COLD1Ind具有更强的低温耐受性，可将粳型COLD1Jap基因导入籼稻品种，以提高籼稻的耐寒性，具有着重要的育种利用价值。研究已证实，粳型COLD1Jap与籼型COLD1Ind存在的SNP2位点DNA序列差异是导致基因功能不同的根本原因。鉴于COLD1基因在耐冷性品种选育中的重要作用，根据粳型COLD1Jap与籼型COLD1Ind在SNP2位点存在的单核苷酸差异，杨佳等(杨佳等，水稻耐低温基因COLD1功能标记的开发及应用，分子植物育种，网络首发地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.s.20190311.0852.002.html，网络首发时间：2019-03-1110:41:37)开发了用于鉴定该基因的衍生型酶切扩增多态性序列(derivedcleavedamplifiedpolymorphicsequence,dCAPS)的功能标记；然而，该功能标记还存在以下一些不足：(1)涉及到限制性内切酶的使用，费用昂贵；(2)涉及到限制内切酶的使用，内切酶酶切时间较长，费工费时，操作繁琐；(3)只能鉴定出COLD1基因的籼、粳类型，不能对籼型的两种不同类型进行鉴定；(4)扩增及酶切后的产物片段较小，适用于操作较为复杂且费时的聚丙烯酰胺上电泳，不利于在操作快速、简单的琼脂糖凝胶上进行电泳。等等。综上所述，COLD1基因具有着重要的育种利用价值，而现有鉴定技术又存在鉴定不彻底，且涉及到限制性内切酶的使用，带来了费用昂贵、操作繁琐及费时费工等弊端。因此，迫切建立一种操作简便、费用低廉及鉴定快速准确的COLD1鉴定方法，以便在育种中更好地推广应用。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术利用dCAPS标记对COLD1基因的不同类型进行判断，涉及到限制性内切酶的使用，导致鉴定费用昂贵、检测流程复杂等诸多弊端，且现有技术不能对籼型COLD1Ind的两种不同等位差异碱基进行判断，本专利技术提供了一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计及其检测方法，能很好地解决了现在技术的存在的不足。本专利技术是这样实现的，一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计，所述水稻耐低温基因COLD1新功能标记由5条引物组成，即正、反向外引物各1条，正向内引物2条，反向内引物1条；正向外引物用COLD1-O-F表示，反向外引物用COLD1-O-R表示；检测粳型COLD1Jap的反向内引物为COLD1-I-R；检测籼型COLD1Ind的正向内引物有两条，序列即COLD1-I-F1和COLD1-I-F2。5条引物序列如下：进一步，一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计，COLD1-O-F序列为SEQIDNO：1；COLD1-O-R序列为SEQIDNO：2；COLD1-I-F1序列为SEQIDNO：3；COLD1-I-F2序列为SEQIDNO：4；COLD1-I-R序列为SEQIDNO：5。进一步，一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计方法，所述水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计方法包括：第一步，从NCBI网站下载水稻COLD1基因的DNA序列；第二步，根据基因在籼型COLD1Ind为碱基T或C，在粳型COLD1Jap为碱基A，设计内引物，内引物的3'端落在SNP差异位点上，与该位点碱基相同或互补；籼型COLD1Ind的特异性内引物为正向内引物COLD1-I-F1和COLD1-I-F2，分别鉴定等位差异碱基T和C，为增强特异性，在两条内引物的3'端的第3个碱基均引入一个错配碱基，即碱基A变为G；粳型COLD1Jap的特异性内引物为反向内引物COLD1-I-R，鉴定等位差异碱基A，同理，为增强特异性，在该引物的3'端的第3个碱基引入一个错配碱基，即碱基C变为T；第三步，在内引物的两翼设计外引物，外引物用在线引物设计软件进行设计，正反外引物均位于保守区域CDS编码区，正向外引物用COLD1-O-F表示，反向外引物用COLD1-O-R表示；进一步，一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记对水稻基因COLD1进行检测的方法，包括以下步骤：第一步，水稻DNA的提取取水稻的叶片0.3-0.4g，按照CTAB方法进行DNA提取。第二步，功能标记的PCR扩增(1)仅检测COLD1基因的粳籼性，即检测COLD1Jap或COLD1Ind，PCR扩增体系为20μL：浓度为10～100ng/L的DNA2μL，5引物混合液2μL，10×TaqBuffer2μL，Mg2+Buffer1.2μL，dNTPMixture0.4μL，TaqDNA聚合酶0.4，ddH2O12μL；(2)当检测到为籼型COLD1Ind时，进一步鉴定其差异性位点碱基，则将(1)的引物混合液组分构成更改，只用任一条正向内引物与两条外引物和1条反向内引物组成4引物，即正向外引物、反向外引物、任一正向内引物和反向内引物组成4引物混合液；PCR扩增体系为20μL：浓度为10～100ng/L的DNA2μL，4引物混合液2μL，10×TaqBuffer2μL，Mg2+Buffer1.2μL，dNTPMixture0.4μL，TaqDNA聚合酶0.4，ddH2O12μL；第三步，琼脂糖凝胶电泳及观察拍照将第二步的(1)和(2)反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的引物，其特征在于，所述水稻耐低温基因COLD1新功能标记由5条引物组成，即正、反向外引物各1条，正向内引物2条，反向内引物1条；正向外引物用COLD1-O-F表示，反向外引物用COLD1-O-R表示；检测粳型COLD1

【技术特征摘要】
1.一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的引物，其特征在于，所述水稻耐低温基因COLD1新功能标记由5条引物组成，即正、反向外引物各1条，正向内引物2条，反向内引物1条；正向外引物用COLD1-O-F表示，反向外引物用COLD1-O-R表示；检测粳型COLD1Jap的反向内引物为COLD1-I-R；检测籼型COLD1Ind的正向内引物有两条，即COLD1-I-F1和COLD1-I-F2；
COLD1-O-F序列为CATTTCCCCATGCCTTCTCC；
COLD1-O-R序列为CAACTGTCCCAACGATACGC；
COLD1-I-F1序列为CCTGGCTTACAGGGAAATTGATGAGAT；
COLD1-I-F2序列为CTGGCTTACAGGGAAATTGATGAGAC；
COLD1-I-R序列为GAGCTGCCTTTCCAATGTTTTGATGTTCT。


2.一种如权利要求1所述水稻耐低温基因COLD1新功能标记引物的设计方法，其特征在于，所述水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计方法包括：
第一步，从NCBI网站下载水稻COLD1基因的DNA序列；
第二步，根据基因在籼型COLD1Ind为碱基T或C，在粳型COLD1Jap为碱基A，设计内引物，内引物的3'端落在SNP差异位点上，与该位点碱基相同或互补；籼型COLD1Ind的特异性内引物为正向内引物COLD1-I-F1和COLD1-I-F2，分别鉴定等位差异碱基T和C，为增强特异性，在两条内引物的3'端的第3个碱基均引入一个错配碱基，即碱基A变为G；粳型COLD1Jap的特异性内引物为反向内引物COLD1-I-R，鉴定等位差异碱基A，同理，为增强特异性，在该引物的3'端的第3个碱基引入一个错配碱基，即碱基C变为T；
第三步，在内引物的两翼设计外引物，外引物用在线引物设计软件进行设计，正反外引物均位于保守区域CDS编码区，正向外引物用COLD1-O-F表示，反向外引物用COLD1-O-R表示；


3.一种利用权利要求1所述的水稻耐低温基因COLD1新功能标记引物对水稻基因COLD1进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，水稻DNA的提取
取水稻的叶片0.3-0.4g，按照CTAB方法进行DNA提取；
第二步，功能标记的PCR扩增
(1)仅检测COLD1基因的粳籼性，即检测COLD1Jap或COLD1Ind，PCR扩增体系为20μL：浓度为10～100ng/L的DNA2μL，5引物混合液2μL，10×TaqBuffer2μL，Mg2+Buffer1.2μL，dNTPMixture0.4μL，TaqDNA聚合酶0.4，ddH2O12μL；
(2)当检测到为籼型COLD1Ind时，进一步鉴定其差异性位点碱基，则将(1)的引物混合液组分构成更改，只用任一条正向内引物与两条外引物和1条反向内引物组成4引物，即正向外引物、反向外引物、任一正向内引物和反向内引物组成4引物混合液；PCR扩增体系为20μL：浓度为10～100ng/L的DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：田孟祥，宫彦龙，何友勋，雷月，张时龙，余本勋，李佳丽，宋治豪，余莉，张大双，闫志强，吴美玲，何远宽，吴瑞，叶永印，
申请(专利权)人：毕节市农业科学研究所，贵州省水稻研究所，
类型：发明
国别省市：贵州;52