一种牡丹皮的转录组SSR分子标记体系及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种牡丹皮的转录组SSR分子标记体系及其应用，通过筛选牡丹皮中10对SSR分子标记引物，该引物体系多态性高、通用性好，能够在多个牡丹样品中体现多态性，并能对不同品种来源的牡丹皮品种及品质进行有效鉴别。

A transcriptome SSR molecular marker system of Cortex Moutan and its application

The invention relates to a transcriptome SSR molecular marker system of peony bark and its application. Through screening 10 pairs of SSR molecular marker primers in peony bark, the primer system has high polymorphism and good universality, can reflect polymorphism in multiple peony samples, and can effectively identify varieties and quality of peony bark from different varieties.

【技术实现步骤摘要】
一种牡丹皮的转录组SSR分子标记体系及其应用
本专利技术属于生物领域，涉及一种牡丹皮的转录组SSR分子标记体系及其应用。
技术介绍
中药牡丹皮为毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，主要分布于我国的重庆、安徽、陕西、河南、山东等地。牡丹皮为常用的大宗药材，临床应用广泛，具有清热凉血、活血化瘀的功效，也是中药临床大品种制剂如六味地黄丸的原材料之一。重庆垫江为川丹皮的传统道地产区；安徽凤丹(P.ostiiT.HongetJ.X.zhang)虽未收入药典，但因药材品质好，也是作为药材市场上牡丹皮的主要来源之一。现有的研究发现，牡丹有近1000个观赏培育品种，由于观赏品种与药用品种在品种选育与栽培模式上有较大差异，一般药用品种为单瓣单色花，牡丹皮质量为佳；观赏品种多为重瓣鲜艳的花，若根皮入药质量不如药用品种。但随着市场对牡丹皮的需求增加，经常有观赏牡丹来源的牡丹皮充斥于药材市场，会导致不同品种牡丹来源的牡丹皮存在明显的质量差异，进而影响到临床疗效。由于不同品种牡丹皮在外观形态上极为相似，难以通过外部形态特征进行区分。因此，亟需建立可靠的鉴定方法来区分不同来源的牡丹皮品种，对药用牡丹与观赏牡丹来源的牡丹皮进行鉴定，以保证牡丹皮药材质量的稳定性。牡丹皮的品质主要体现在有效成分的含量，而有效成分的积累依赖于植物体内生物合成通路中的功能性基因，通过解析功能性基因的特征属性，可为药材品质形成及评价提供重要参考。而对功能基因的特征标记，可作为药材品质评价及优良品种培育的指标。分子标记已成为揭示物种的遗传多样性和品种鉴定最重要的工具之一。目前常用的分子标记类型包括限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、酶切扩增多态性序列(CAPS)、单核甘酸多态性(SNP)、简单重复序列(SSR)等。其中，SSR(simplesequencerepeat)又称为微卫星序列，是由1～6个核苷酸为重复基元重复多次组成的DNA序列，它们的长度大约为100～200个碱基对，广泛存在于真核生物基因组中。SSR序列具有分布广泛、共显性遗传、多态性位点多、信息含量丰富、物种间转移性好、易于检测和可重复性好的特点，已被广泛应用于品种鉴定，种质资源保存和利用、遗传多样性分析、分子标记辅助选育等研究领域。基于转录组中的SSR分子标记既可避免基因组SSR(genomic-SSR)周期长、成本高，以及EST-SSR的数据量少的问题，又具有genic-SSR的优点；同时，这种技术也充分利用了转录组测序的结果。从已经开展的研究发现基于转录组SSR开发的分子标记多态性和扩增效果较好，说明转录组SSR适宜用来进行分子标记的开发。牡丹作为重要的观赏植物，具有“多地、多种、多元”起源的特点，有着极其丰富的遗传多样性。在作物育种中，深入了解分子多样性，是研究作物遗传多样性、鉴定品种和选择杂交亲本的基础，但牡丹在这方面的研究偏少，主要集中在对牡丹品种鉴定、起源等研究，研究则偏重于牡丹花的观赏性，而忽略了该植物的药用价值。部分地区的牡丹品种通过分子标记研究发现其具有丰富的遗传多样性。采用RAPD技术对四川彭州地区的牡丹品种进行分析，发现多数来源地相同的品种表现为较为密切的亲缘关系；在构建中原牡丹核心种质资源库研究中，根据品种来源、分类体系等基本数据和形态、分子标记特征数据，建立了中原牡丹品种的表型数据库和品种的分子数据库。并通过构建中原牡丹品种的初级核心种质资源，进行ISSR和AFLP标记证明构建的核心种质具有丰富的遗传多样性。CDDP标记也被尝试用于牡丹的遗传多样性分析，品种特异性分析和一致性检验，以筛选区分牡丹种质资源的核心引物和探讨牡丹分子身份证的构建方法。于海萍等以凤丹为实验材料，利用磁珠富集法开发SSR标记，探讨了凤丹在芍药组植物中的交叉扩增能力，发现紫斑牡丹是西北牡丹品种群的主要原种之一，且二者与四川牡丹有较近的亲缘关系；凤丹参与了中原牡丹品种群的起源；系个体与中原牡丹品种群个体也有一定的亲缘关系。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种牡丹皮的转录组SSR分子标记体系及其应用，通过功能基因的遗传多态性对不同来源的牡丹皮药材及饮片品种及品质进行有效的鉴定和区分。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、一种牡丹皮的转录组SSR分子标记体系，包括以下10个引物对：引物对P1，其核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；引物对P2，其核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；引物对P3，其核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；引物对P4，其核苷酸序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；引物对P5，其核苷酸序列如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示；引物对P6，其核苷酸序列如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示；引物对P7，其核苷酸序列如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示；引物对P8，其核苷酸序列如SEQIDNO.15和SEQIDNO.16所示；引物对P9，其核苷酸序列如SEQIDNO.17和SEQIDNO.18所示；引物对P10，其核苷酸序列如SEQIDNO.19和SEQIDNO.20所示。2、上述一种牡丹皮的转录组SSR分子标记体系在牡丹皮的品种鉴定和品质评价中的应用。优选的，所述牡丹皮包括但不限于单瓣红、重瓣红、凤丹或洛阳观赏牡丹品种，所述洛阳观赏牡丹品种包括但不限于赵粉、葛巾紫、丁香紫、大棕紫、萍实艳、海黄、姚黄、洛阳锦、黑牡丹、白牡丹。3、上述一种牡丹皮的转录组SSR分子标记体系的构建方法，具体步骤如下：(1)提取新鲜牡丹皮样品RNA，构建牡丹皮转录组文库并进行测序分析，获得牡丹皮转录组序列，并用Trinity软件对转录本进行拼接得到Unigene；(2)Unigene功能注释使用BLAST软件将Unigene序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、eggNOG4.5、KEGG数据库比对，使用KOBAS2.0得到Unigene在KEGG中的KEGGOrthology结果，预测完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER软件与Pfam数据库比对，获得Unigene的注释信息，得到参与牡丹皮中有效成分如丹皮酚、芍药苷、没食子酸等生物合成通路中的功能基因或片段，独立建成功能基因数据库；(3)使用MISA软件对功能基因数据库中核苷酸长度大于1000bp的Unigene进行SSR位点的筛选和分析；从得到的总SSR中再设置条件进行筛选，筛选标准：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为9、6、5、4、4；(4)采用Primer5软件设计SSR引物，引物设计参数为引物长度为18～25bp；PCR扩增产物长度为100～400bp；GC含量为40％～60％；(5)对步骤(4)所设计的引物在不同牡丹皮样本中进行可扩增性和通用性鉴定，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牡丹皮的转录组SSR分子标记体系，其特征在于，包括以下10个引物对：/n引物对P1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；/n引物对P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；/n引物对P3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；/n引物对P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；/n引物对P5，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；/n引物对P6，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；/n引物对P7，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；/n引物对P8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；/n引物对P9，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示；/n引物对P10，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种牡丹皮的转录组SSR分子标记体系，其特征在于，包括以下10个引物对：
引物对P1，其核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；
引物对P2，其核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；
引物对P3，其核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；
引物对P4，其核苷酸序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；
引物对P5，其核苷酸序列如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示；
引物对P6，其核苷酸序列如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示；
引物对P7，其核苷酸序列如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示；
引物对P8，其核苷酸序列如SEQIDNO.15和SEQIDNO.16所示；
引物对P9，其核苷酸序列如SEQIDNO.17和SEQIDNO.18所示；
引物对P10，其核苷酸序列如SEQIDNO.19和SEQIDNO.20所示。


2.权利要求1所述一种牡丹皮的转录组SSR分子标记体系在牡丹皮的品种鉴定和品质评价中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述牡丹皮包括但不限于单瓣红、重瓣红、凤丹或洛阳观赏牡丹品种，所述洛阳观赏牡丹品种包括但不限于赵粉、葛巾紫、丁香紫、大棕紫、萍实艳、海黄、姚黄、洛阳锦、黑牡丹、白牡丹。


4.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张迎春，曾忠良，葛梅，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50