本发明专利技术提供了一种用于牡丹皮药材、中间体和制剂产品多成分质量控制方法。该方法在细胞膜固相色谱技术和糖基化孵育体系筛选出供选择成分群；结合聚类分析和主成分分析确定氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚6个主成分基础上，采用同一液相色谱条件建立牡丹皮药材、丹皮提取物中间体、牡丹皮制剂产品中氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚的含量同步测定方法；能准确测定这6个成分含量，并确定成分组成结构比范围为：(1.3~1.5): (10.4~13.9): 0.5:(2.7~3.5): (1.0~1.2): (14.9~ 16.1)。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于中医药研宄方 法学领域。
技术介绍
目前国内外中药药材、中间体、制剂质量控制的方法是在化学成分研宄的基础上， 建立中药中的某一或两个有效成分（主成分）的定性、定量分析方法，进而控制中药的质 量。但这种质量控制方法未能体现中药整体特点，也未能给出这些质控指标与药效相关的 证据，更值得关注的是这些成分的质量控制不是越高越好，而是不同的成分应该控制在一 定范围比例内，即"组分结构"。很多研宄案例结果显示中药（复方）的最佳药效是多种药 材或组分之间组成结构的生物学反映。 牡丹皮为双子叶植物，是毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥的 根皮。产于安徽、四川、河南、山东等地。牡丹皮始载于《神农本草经》，列为中品，具有清热 凉血、活血化淤、退虚热等功效。现代学者对牡丹皮的化学成分进行了许多药理效应研宄， 认为其具有心血管系统作用、保肝、降血糖、降血脂、降血压等作用，还具有中枢神经系统作 用。对牡丹皮及其产品的质量控制，2010年《中国药典》质量控制标准规定药材含丹皮酚不 得少于1. 2%，该质控标准不能客观准确反应牡丹皮的药材质量。在《中国药典》中收录的 近40种成方制剂，对于牡丹皮药材来说，质控指标仅一个或不涉及。 本技术基于活性成分的筛选，结合主成分分析、聚类分析等手段，揭示了牡丹皮药 材、中间体、制剂的组成结构特征，确定多成分指标的质控范围，为牡丹皮药材及制剂提供 一种多组分质量控制方法。【附图说明】 图1肾系膜细胞固相化牡丹皮提取物产物色谱图（A)及化学结构图（B)，其中（a) 牡丹皮孵育液；(b)最后一次PBS洗涤液；（c)空白解离液；（d)固相化产物解离液 图2牡丹皮提取物抑制AGES生成色谱图（A)及化学结构图（B)，其中（a)牡丹皮 孵育液；(b)丙酮醛孵育液；（c)牡丹皮与丙酮醛孵育液图3牡丹皮提取物抑制血小板聚集生成色谱图（A)及化学结构图（B)，其中（a)牡 丹皮孵育液；(b)最后一次PBS洗涤液；（c)空白解离液；（d)固相化产物解离液 图4HPLC法测定的不同产地牡丹皮（A)及成分聚类分析结果（B)，注：从前向后依 次为湖南、安徽、甘肃、重庆、四川、贵州、河南、河北、浙江、山东产地的牡丹皮吸收峰。 图5效应物质对AGES诱导的SOD活性（A)及MDA含量⑶的影响 图6效应物质系膜细胞FN蛋白表达的影响 图7效应物质血管内皮细胞凋亡的影响，其中：a，200yg/mL牛血清白蛋白；b，200yg/mLAGEs;c,氨基胍（10yM) +200yg/mLAGEs;d,丹皮酚pae(10-4M) +200yg/ mLAGEs;e,三没食子酰葡萄糖（10-4M)+200yg/mLAGEs;f,五没食子酰葡萄 糖（10-4M)+200yg/mLAGEs;g,芍药苷（10-4M)+200yg/mLAGEs;h,氧化芍药苷 (10-4M) +200yg/mLAGEs;i,苯甲酰芍药苷（10-4M) +200yg/mLAGEs.AGEs组和BSA组相 比，###p〈〇. 〇〇l;样品组与AGEs组相比，*P〈0. 05, #P〈0. 01, *#P〈0. 001。 图8牡丹皮药材、中间体、配方颗粒6个有效成分HPLC色谱图 图9不同产地牡丹皮对肾系膜细胞ICAM-1、TGF-M和FN表达的影响及药效聚类 分析
技术实现思路
解决的技术问题： 本专利技术针对牡丹皮药材、中间体及制剂产品的质量检测现状，提供一种基于高效 液相色谱法的牡丹皮药材、中间体及制剂产品质量检测方法，通过主成分分析和聚类分析 统计方法，获得主要的质控指标，并经药理活性评估证明其有效，确定指标成分的控制范 围，为。 技术方案： 基于中医药整体性特点，采用现代活性成分筛选技术筛选牡丹皮药材中多个活性 成分，结合数理统计聚类分析和主成分分析，确定与药效相关的6个主要成分，经抗AGEs 诱导的肾系膜细胞和血管内皮细胞的活性评估，并确定这些成分的组成结构特征及检测范 围，对其药材、中间体、制剂产品进行质量检测。 本专利技术提供的，其主要包括以下 步骤： (1)采用细胞膜固相色谱技术和糖基化产物共孵育体系筛选与血小板、肾系膜细 胞、抑制糖基化产物生成的成分，并对这些成分进行辨识和解析，确定13个成分。 (2)根据步骤（1)采取聚类分析根据成分进行聚类分析，并采用主成分分析确定6 个与药效活性相关的主成分。 (3)根据步骤⑵中确定的6个活性成分，评价其对抗糖基化产物AGES对肾系膜 细胞和血管内皮细胞损伤的保护活性。 (4)根据步骤⑵和⑶中确定的6个活性成分，建立检测牡丹皮药材、中间体及 制剂的HPLC条件： a.液相色谱条件：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈 (A)-0? 1 % 甲酸水溶液（B)，梯度洗脱条件：0-20min，5 % -10 %A;20-30min，10 % -10 %A; 30-80min，10 % -18 %A;80-120min，18 % -50 %A;检测波长 254nm，流速 0? 8mL/min，柱温 25 °C。 b.对照品溶液的制备：分别精密称取恒重的对照品氧化芍药苷、芍药苷、三没食 子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚适量，加60%甲醇溶液分别制成每 lmL含芍药苷72. 15yg、氧化芍药苷59. 56yg、三没食子酰葡萄糖89. 35yg、五没食子酰葡 萄糖109. 76yg、苯甲酰芍药苷137. 67yg和丹皮酚86. 23yg，用甲醇定容至刻度，摇匀；另 各取lmL配成混合对照品溶液。 c.供试品溶液的制备牡丹皮药材供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮药材粉末约0. 5g，置50mL容量瓶 中，加75%乙醇（v/v)20mL，超声或回流处理30min(两次），取出，放冷，合并滤液，加75% 乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0. 45ym的微孔滤膜滤过，即得； 牡丹皮提取物供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮提取物0.lg，置50mL容量瓶 中，加75%乙醇（v/v)20mL，超声或回流处理30min(两次），取出，放冷，合并滤液，加75% 乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0. 45ym的微孔滤膜滤过，即得； 牡丹皮制剂供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮制剂粉末约0. 25g，置50mL容 量瓶中，加75%乙醇（v/v) 20mL，超声或回流处理30min(两次），取出，放冷，合并滤液，加 75%乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0. 45ym的微孔滤膜滤过，即得； d.测定法：高效液相色谱仪分析对照品和供试品溶液，进样体积10yL。 (5)根据步骤（4)中建立的HPLC检测方法，结合药效分析和聚类分析，确定质量检 测范围。 有益效果：针对牡丹皮药材、中间体及制剂产品的质量检测缺点，本专利技术基于活性 筛选，结合数理统计方法，确定主成分，利用高效液相色谱同步检测技术，建立氧化芍药苷、 芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚含量同步测定方 法，并确定最佳控制范围，进一步保证牡丹皮药材药材、中间体、制剂产品的质当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法，其特征在于检测指标成分是通过肾系膜细胞、血小板细胞膜固相色谱技术和糖基化产物反应体系筛选，结合聚类分析和主成分分析确定的，采用HPLC法，确定氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚为检测指标，所述6个检测指标的含量HPLC法同步测定方法如下：①液相色谱条件：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈(A)‑0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱条件：0‑20min，5％‑10％A；20‑30min，10％‑10％A；30‑80min，10％‑18％A；80‑120min，18％‑50％A；检测波长254nm，流速0.8mL/min，柱温25℃；②对照品溶液的制备：分别精密称取恒重的对照品氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚适量，加60％甲醇溶液分别制成每1mL含芍药苷72.15μg、氧化芍药苷59.56μg、三没食子酰葡萄糖89.35μg、五没食子酰葡萄糖109.76μg、苯甲酰芍药苷137.67μg和丹皮酚86.23μg，用甲醇定容至刻度，摇匀；另各取1mL配成混合对照品溶液；③供试品溶液的制备牡丹皮药材供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮药材粉末约0.5g，置50mL容量瓶中，加75％乙醇(v/v)20mL，超声或回流处理30min两次，取出，放冷，合并滤液，加75％乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0.45um的微孔滤膜滤过，即得；牡丹皮提取物供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮提取物0.1g，置50mL容量瓶中，加75％乙醇(v/v)20mL，超声或回流处理30min两次，取出，放冷，合并滤液，加75％乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0.45um的微孔滤膜滤过，即得；牡丹皮制剂供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮制剂粉末约0.25g，置50mL容量瓶中，加75％乙醇(v/v)20mL，超声或回流处理30min两次，取出，放冷，合并滤液，加75％乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0.45um的微孔滤膜滤过，即得；④测定法：高效液相色谱仪分析对照品和供试品溶液，进样体积10μl。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：封亮，贾晓斌，张明华，顾俊菲，汪春飞，
申请(专利权)人：江苏省中医药研究院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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