一种筛选活性成分和活性组合物的方法技术

本发明专利技术涉及高通量筛选领域，具体涉及一种基于生物化学反应发现活性成分以及活性组合物的方法。本发明专利技术首先通过对洗脱条件和酶促反应条件进行考察及优化，完成在线装置的搭建；其次将准备好的样品进样，完成化合物的分离以及活性成分的筛选；然后利用高分辨质谱技术对活性成分进行结构鉴定；最后围绕发现的活性成分自由组合，利用在线装置探究其相互作用关系。本发明专利技术集生物活性成分的发现、分离及鉴定于一体，尤其适用于化合物种类复杂的体系。与此同时，本发明专利技术在提高筛选的准确率、降低假阳性结果上表现出明显的优势，是一种有效、可靠的高通量筛选方法。

A process for screening active and active compositions

The present invention relates to the field of high throughput screening, in particular to a method based on biochemical reactions to find active ingredients and active compositions. The present invention based on elution conditions and enzymatic reaction conditions were studied and optimized, built the online device; secondly the prepared sample screening, complete separation of compounds and active ingredients; then using high resolution mass spectrometry to identify the structure of the active component; finally on active ingredient free combination found. By exploring the interaction between Online devices. The invention integrates the discovery, separation and identification of biologically active ingredients, and is especially suitable for complex systems with complex compounds. At the same time, the invention has obvious advantages in improving the accuracy of screening and reducing false positive results, and is an effective and reliable high throughput screening method.

【技术实现步骤摘要】
一种筛选活性成分和活性组合物的方法
本专利技术涉及高通量筛选领域，具体涉及一种基于生物化学反应发现活性成分以及活性组合物的方法。
技术介绍
据统计，从1981年到2010年的30年间，约有34％的新药来源于天然产物。作为天然产物在临床使用的一个重要来源，中药在几千年的历史长河中对中国人民的医疗保健起着十分重要的作用。尤其在治疗复杂的慢性疾病方面，中药疗效良好且副作用较低，这使得越来越多的人意识到从中药中寻找潜在的生物活性物质很可能会提高药物发现的速率和效率。建立一种高效快速的筛选方法找到中药中的生物活性成分对于新药的研发具有十分重要的意义。传统发现中药活性成分的方法是在中药化学成分提取、分离和结构鉴定基础上，利用分子和细胞、离体器官和组织、整体动物等药理模型对得到的单体化合物进行生物活性测试。该方法利用各种提取分离技术(如薄层色谱、低中压柱色谱、逆流色谱、制备色谱法)分离制备中药中的各种成分，经药理活性测试后确定其有效成分，操作繁琐，周期长，最后分离得到的化合物可能没有活性或不是所需要的，是一种命中率较低的筛选方法。将中药天然产物库和高通量筛选技术集成，应用高通量筛选模型对中药化合物库进行筛选的方法已成为目前创新药物的重要技术手段之一。高通量筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系，它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统进行实验过程，以灵敏快速的检测仪器釆集实验数据，实现了较短时间内对数以千、万计的样品进行活性评价，并以相应的数据库支持整个技术体系的正常运转。高通量筛选技术由于其快速、高效、分析样本量大等特点，在寻找新的活性化合物方面有非常的优势。此外，不同于西药“单一药物作用于单一靶点”的作用模式，中药发挥疗效是其中多个功能组分的整体表现，是多成分、多靶点协同作用的结果。中药具有多成分组成，多靶点治疗的特色。随着科学的进步，人们对于中药的认识发生了一定的改变，越来越多的研究者意识到，中药发挥药效并不是单个成分作用的简单叠加，多成分彼此之间存在某种作用关系，或加和或协同或拮抗，它们可作用于多个靶点相互影响，从整体上发挥药效。因此，建立某种方法发现具有协同作用的药物组合对于新药的研发具有非常重要的意义。本专利技术要解决的问题在于：建立一种基于在线生物化学反应的集生物活性成分的发现、分离与鉴定于一体，同时也能用于探究多成分间相互作用的筛选方法。技术方案本专利技术涉及一种筛选活性成分的方法，其特征是，步骤如下：(1)将准备好的样品自动进样，在一定的洗脱条件下分离待测物，同时补偿泵调节洗脱液中的有机相，使之维持在一个恒定的范围内；调节后的洗脱液流经酶泵，在第一个反应线圈中与酶溶液相互作用；然后混合液经过底物泵，在第二个反应线圈中酶催化底物，观察产物吸收波长(470nm)下是否有倒峰生成，实现活性成分的分离及筛选；待测物的分离以及洗脱液补偿的有机溶剂可以是甲醇、或、乙腈；待测物可以是单体化合物、由单体组成的组合物、天然产物提取物、或、中药复方提取物；参与反应的酶是以过氧化氢为底物，以愈创木酚为显色剂，含有血红素的过氧化物酶家族中的一员，来源可以是动物、植物、或、微生物；(2)利用质谱技术对活性成分进行结构鉴定；(3)围绕活性成分自由组合，利用在线装置探究其作用关系。本专利技术涉及的方法，其特征在于，分离泵和补偿泵的流速一般一致，可以是0.2～0.5mL/min；优选地，流速为0.25mL/min。本专利技术涉及的方法，其特征在于，用于样品分离和洗脱液补偿的水相溶剂可以是纯水、或、酸水溶液，酸水溶液可以是pH为1-3的甲酸、或、乙酸。本专利技术涉及的方法，其特征在于，第二个反应线圈的长度可以是40～120cm；优选地，反应线圈2的长度为100cm；反应线圈2的内径可以是0.5～0.8mm；优选地，反应线圈2的内径是0.8mm。本专利技术涉及的方法，其特征在于，酶的浓度可以是0.5～2.5U/mL；优选地，酶溶液的浓度为2U/mL。本专利技术涉及的方法，其特征在于，底物过氧化氢和显色剂愈创木酚的浓度可以是0.5～25mM；优选地，底物过氧化氢和显色剂愈创木酚的浓度均为25mM。本专利技术涉及的方法，其特征在于，用0.2mol/LpH6.0的磷酸盐缓冲液溶解酶和底物、显色剂。本专利技术涉及的方法，其特征在于，待测化合物可以是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、杨梅素、丹参素、紫草酸、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸D、或、迷迭香酸中的一种、或、几种，也可以是含有这些成分的中药提取物、或、中药复方提取物。本专利技术涉及的方法，其特征在于，组合物可以是上一条特征中提及的任意两种、或、多种单体成分的组合。本专利技术涉及的仪器：在运用在线装置实现活性成分筛选的过程中，待测物经过液相分离后直接与泵入装置中的酶以及底物发生反应。考虑到成分洗脱时流动相中含有的有机溶剂会影响酶活性，在化合物参与生物活性测定之前需要有一个流动相补偿体系来调节洗脱液中有机溶剂的含量，以确保反应顺利进行。因此，整套在线装置由Agilent液相的7个模块构成，涉及的仪器包括1个自动进样器(1100系列)，1个柱温箱(1100系列)，1个多波长DAD检测器(1100系列)以及4个高效液相泵(二元泵或四元泵)，这些泵分别用于实现待测物的分离、流动相的补偿，提供酶以及底物。附图说明图1：实施例1中EGCG在不同浓度下对过氧化物酶的抑制作用。图2：实施例2中运用在线装置筛选待测混合物中抑制过氧化物酶的活性成分。图3：实施例2中过氧化物酶样品和空白样品分别与待测混合物孵育、超滤后的高效液相色谱图。图4：实施例3中运用在线装置筛选丹参水提取物中抑制过氧化物酶的有效物质。图5：实施例4中运用在线装置探究EGCG与EGC之间对过氧化物酶的相互作用。图6：实施例6中探究待测物分离体系内有机溶剂对过氧化物酶活性的影响。图7：实施例6中考察分离流速对产物峰响应程度的影响。图8：实施例7中基于在线生物化学反应筛选活性成分的装置图。进一步的具体解释图2其中，峰1是EGC，峰2是芍药苷，峰3是ECG，峰4是柚皮苷，峰5是橙皮苷，峰6是杨梅素。图3其中，虚线示空白样品与待测混合物孵育、超滤后的高效液相色谱图，实线示过氧化物酶与待测混合物孵育、超滤后的高效液相色谱图。其中，峰1是EGC，峰3是ECG，峰4是柚皮苷，峰5是橙皮苷，峰6是杨梅素。图5其中，符号“*”代表显著性差异值P<0.05；符号“#”代表显著性差异值P<0.01。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的具体实施方式进行描述，更好地理解本专利技术，本专利技术不受具体实施方式的限制。实施例1测定表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对过氧化物酶的作用试剂与耗材：乙腈、甲酸(HPLC级，德国Merck公司)；AgilentZorBaxSB-C18分析柱，规格为250×4.6mm，5μm(美国Agilent公司)；过氧化物酶(华中海威基因科技有限公司)、愈创木酚(阿拉丁试剂(上海)有限公司)、DMSO(美国Sigma公司)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、30％的过氧化氢溶液(江苏南京化学试剂有限公司)0.2mol/LpH6.0的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选活性成分的方法，其特征是，步骤如下：(1)将准备好的样品自动进样，在一定的洗脱条件下分离待测物，同时补偿泵调节洗脱液中的有机相，使之维持在一个恒定的范围内；调节后的洗脱液流经酶泵，在第一个反应线圈中与酶溶液相互作用；然后混合液经过底物泵，在第二个反应线圈中酶催化底物，观察产物吸收波长(470nm)下是否有倒峰生成，实现活性成分的分离及筛选；待测物的分离以及洗脱液补偿的有机溶剂可以是甲醇、或、乙腈；待测物可以是单体化合物、由单体组成的组合物、天然产物提取物、或、中药复方提取物；参与反应的酶是以过氧化氢为底物，以愈创木酚为显色剂，含有血红素的过氧化物酶家族中的一员，来源可以是动物、植物、或、微生物；(2)利用质谱技术对活性成分进行结构鉴定；(3)围绕活性成分自由组合，利用在线装置探究其作用关系。

【技术特征摘要】
1.一种筛选活性成分的方法，其特征是，步骤如下：(1)将准备好的样品自动进样，在一定的洗脱条件下分离待测物，同时补偿泵调节洗脱液中的有机相，使之维持在一个恒定的范围内；调节后的洗脱液流经酶泵，在第一个反应线圈中与酶溶液相互作用；然后混合液经过底物泵，在第二个反应线圈中酶催化底物，观察产物吸收波长(470nm)下是否有倒峰生成，实现活性成分的分离及筛选；待测物的分离以及洗脱液补偿的有机溶剂可以是甲醇、或、乙腈；待测物可以是单体化合物、由单体组成的组合物、天然产物提取物、或、中药复方提取物；参与反应的酶是以过氧化氢为底物，以愈创木酚为显色剂，含有血红素的过氧化物酶家族中的一员，来源可以是动物、植物、或、微生物；(2)利用质谱技术对活性成分进行结构鉴定；(3)围绕活性成分自由组合，利用在线装置探究其作用关系。2.根据权利要求1所述的一种筛选活性成分的方法，其特征在于，分离泵和补偿泵的流速可以是0.2～0.5mL/min。3.根据权利要求1所述的一种筛选活性成分的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：李萍，杨华，邬思琪，宋慧鹏，赵小艾，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32