利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法技术

本发明专利技术公开了利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法。具体包括以下步骤：确定asap1a基因敲除的靶点位置即asap1a‑gRNA靶位点，体外转录获得asap1a‑gRNA，将asap1a‑gRNA与Cas9mRNA导入斑马鱼受精卵中，筛选培养获得稳定遗传的asap1a基因敲除突变体。本发明专利技术根据选择的asap1a基因的一段独特的高效率打靶区，利用CRISPR/Cas9技术使得斑马鱼中的asap1a基因被敲除并产生可遗传的asap1a基因敲除的斑马鱼，且本发明专利技术共获得了3种突变类型的asap1a基因敲除突变体斑马鱼品系，对研究asap1a基因的功能奠定动物模型基础。

Construction of zebrafish asap1a gene knockout mutant by CRISPR / cas9

The invention discloses a method for constructing a zebrafish asap1a gene knockout mutant by using CRISPR / cas9 technology. The specific steps are as follows: determine the target site of asap1a gene knockout, that is, asap1a \u2011 gRNA target site, obtain asap1a \u2011 gRNA by transcription in vitro, transfer asap1a \u2011 gRNA and cas9mrna into the fertilized eggs of zebrafish, screen and culture the stable genetic asap1a gene knockout mutants. According to a unique high-efficiency target region of the selected asap1a gene, the invention uses CRISPR / cas9 technology to knock out the asap1a gene in zebrafish and generate the genetic asap1a gene knock-out zebrafish, and the invention obtains three types of mutation asap1a gene knock-out mutant zebrafish strains, which lays the foundation of animal model for the study of the function of asap1a gene.

【技术实现步骤摘要】
利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法
本专利技术涉及一种斑马鱼突变体
，尤其涉及一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法。
技术介绍
CRISPR/Cas9系统作为近年来新兴的一种基因编辑技术工具，其最初发现来源于细菌或古细菌在长期进化过程中形成的一种抵抗病毒和质粒侵袭的获得性免疫防御机制。CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat,CRISPR)是指规律成簇的间隔短回文重复序列，能够靶向和干扰侵入的同源DNA序列。Cas9具有核酸外切酶的活性，在与crRNA(CRISPR-derivedRNA)配对的序列靶位点附近剪切双链DNA。CRISPR/Cas9具体是将改造后的crRNA即gRNA(guideRNA)和Cas9mRNA混合导入目标体系后引发DNA错配修复造成基因的突变，进而完成对靶位点DNA的定向切割。由于gRNA设计合成方便，且此系统对靶基因敲除效率的高效性，使得CRISPR/Cas9系统成为继锌指核酸酶(zincfingerendonuclease,ZFN)与转录激活样效应分子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)等敲除技术之后的又一种应用更为广泛的基因编辑技术，目前该技术广泛应用于细胞与动物模型的遗传学改造。斑马鱼asap1a位于第二号染色体，CDS区约3400bp，29个外显子，编码蛋白约130kDa，与人ASAP1蛋白的同源性可达76％，目前关于斑马鱼asap1a基因的解释与功能验证未见报道。人类ASAP1(ADPribosylationfactor-GTPaseactivatingprotein)是ADP-核糖基化因子(ADP-ribosylationfactors，Arf)的GTP酶激活蛋白，关于ASAP1的功能主要集中在与细胞内吞、细胞内膜泡转运与细胞骨架的运动调控方面，还与肿瘤的转移和扩散有关。ASAP1作为近年来新发现的结核易感基因，首先由剑桥大学研究者通过GWAS筛选得到，他们发现位于ASAP1内含子的11个SNP位点与结核病易感染性相关，之后国内研究者在不同地区、种族人群中进行了ASAP1关联性研究及连锁分析，且对ASAP1的功能和影响结核易感的机制在细胞水平上作出了初步探究，现主要集中在ASAP1蛋白表达对于免疫细胞迁徙能力的调控进而影响人类对于结核病的易感性。斑马鱼作为近年来新型的模式生物日益成为体内试验理想的动物模型，且已经被逐渐用作研究疾病致病机理的良好材料。目前斑马鱼-海鱼分枝杆菌模型被广泛应用于结核病致病机理的基础研究，此模型的显著优势在于海鱼分枝杆菌感染斑马鱼与结核分枝杆菌感染人的病理病程极其相似，并且斑马鱼拥有与人类相似的复杂的免疫系统，发育早期机体呈现透明状，这极大地方便了研究者实时观察和动态研究细菌感染与机体病理损伤过程，如：肉芽肿的形成和成熟。因此，在斑马鱼中利用基因编辑的手段对结核病易感基因改造，建立以斑马鱼为生物模型的结核病动物模型，对研究结核病易感基因的功能和结核病药物的筛选具有良好的指导意义。但是，目前国内鲜有利用反式遗传学手段在斑马鱼模型中研究结核易感病理的报道，也未有利用基因编辑技术产生斑马鱼asap1a基因突变体的报道。本专利则通过CRISPR/Cas9技术建立斑马鱼asap1a敲除突变体，为深入研究asap1a的基本功能和结核病易感机制提供材料基础。
技术实现思路
为了填补对于斑马鱼asap1a基因基本功能的认识空白以及探究结核病易感性调节机制，利用基因编辑的手段对斑马鱼asap1a进行改造建立基因敲除动物模型就显得尤为重要，本专利技术的目的在于提供一种高效的利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，具体是通过以下技术步骤来实现的：S1.在斑马鱼asap1a基因上选择asap1a-gRNA靶位点，分析确认asap1a-gRNA靶位点敲除特异性；S2.制备asap1a-gRNA；S3.将asap1a-gRNA和Cas9mRNA导入斑马鱼中制备F0代斑马鱼，并鉴定asap1a-gRNA靶位点打靶效率；S4.鉴定F0代斑马鱼子代即F1代斑马鱼卵中asap1a基因类型，进而筛选出亲本F0代斑马鱼中可以遗传的asap1a敲除突变体；S5.筛选F2代斑马鱼中asap1a基因敲除纯合突变体，培养获得稳定遗传的斑马鱼asap1a基因敲除突变体，即完成利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼asap1a基因敲除突变体的构建。作为上述方案的进一步改进，所述步骤S1中asap1a-gRNA靶位点序列为SEQIDNO.1所示序列。其中靶位点的选择应遵循3’端为NGG的原则(N代表任意碱基)。作为上述方案的进一步改进，所述步骤S1中asap1a-gRNA靶位点位于斑马鱼asap1a基因第五个外显子上。本方法首先选择在Asap1a蛋白的第一个结构域设置靶位点，有效地降低了因CRISPR/Cas9敲除后产生的截短蛋白对后续基因功能研究的干扰。作为上述方案的进一步改进，所述步骤S2中制备asap1a-gRNA的方法为：S2.1将asap1a-gRNA靶位点的DNA序列连接入pDR274载体；S2.2从重组的pDR274-asap1a-gRNA质粒中扩增T7promoter-asap1a-gRNA；S2.3扩增的产物进行PCR产物回收并进行体外转录得到asap1a-gRNA。通过琼脂糖凝胶电泳与Nanodrop仪器检测asap1a-gRNA纯度，高质量的gRNA的合成可以最大程度的为后续生物体内敲除实验提供分子材料保证。作为上述方案的进一步改进，所述步骤S2.1中将asap1a-gRNA靶位点的DNA序列连接入pDR274载体的引物序列为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示序列。通过Sanger测序鉴定pDR274-asap1a-gRNA是否连接成功。作为上述方案的进一步改进，所述步骤S2.2中扩增T7promoter-asap1a-gRNA引物序列为SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示序列。扩增的产物T7promoter-asap1a-gRNA通过进行琼脂糖凝胶电泳验证分子量是否与预期相符，保证后续体外转录实验的准确性。作为上述方案的进一步改进，所述步骤S3将asap1a-gRNA和Cas9mRNA导入斑马鱼中制备F0代斑马鱼，并鉴定asap1a-gRNA靶位点打靶效率，具体为：S3.1将体外转录获得的asap1a-gRNA与Cas9mRNA混合后通过显微注射导入斑马鱼受精卵，其中asap1a-gRNA终浓度为100ng/μL，Cas9mRNA终浓度为300ng/μL，导入体积为：1nL/卵；S3.2选取50粒已经导入asap1a-gRNA与Cas9mRNA的受精后24h斑马鱼卵并混合提取鱼本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，其特征在于：包括如下步骤：/nS1.在斑马鱼asap1a基因上选择asap1a-gRNA靶位点，分析确认asap1a-gRNA靶位点敲除特异性；/nS2.制备asap1a-gRNA；/nS3.将asap1a-gRNA和Cas9mRNA导入斑马鱼中制备F0代斑马鱼，并鉴定asap1a-gRNA靶位点打靶效率；/nS4.鉴定F0代斑马鱼子代即F1代斑马鱼卵中asap1a基因类型，进而筛选出亲本F0代斑马鱼中可以遗传的asap1a敲除突变体；/nS5.筛选F2代斑马鱼中asap1a基因敲除纯合突变体，培养获得稳定遗传的斑马鱼asap1a基因敲除突变体，即完成利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼asap1a基因敲除突变体的构建。/n

【技术特征摘要】
1.利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1.在斑马鱼asap1a基因上选择asap1a-gRNA靶位点，分析确认asap1a-gRNA靶位点敲除特异性；
S2.制备asap1a-gRNA；
S3.将asap1a-gRNA和Cas9mRNA导入斑马鱼中制备F0代斑马鱼，并鉴定asap1a-gRNA靶位点打靶效率；
S4.鉴定F0代斑马鱼子代即F1代斑马鱼卵中asap1a基因类型，进而筛选出亲本F0代斑马鱼中可以遗传的asap1a敲除突变体；
S5.筛选F2代斑马鱼中asap1a基因敲除纯合突变体，培养获得稳定遗传的斑马鱼asap1a基因敲除突变体，即完成利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼asap1a基因敲除突变体的构建。


2.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S1中asap1a-gRNA靶位点序列为SEQIDNO.1所示序列。


3.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S1中asap1a-gRNA靶位点位于斑马鱼asap1a基因第五个外显子上。


4.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S2中制备asap1a-gRNA的方法为：
S2.1将asap1a-gRNA靶位点的DNA序列连接入pDR274载体；
S2.2从重组的pDR274-asap1a-gRNA质粒中扩增T7promoter-asap1a-gRNA；
S2.3扩增的产物进行PCR产物回收并进行体外转录得到asap1a-gRNA。


5.根据权利要求4所述的利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S2.1中将asap1a-gRNA靶位点的DNA序列连接入pDR274载体的引物序列为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示序列。


6.根据权利要求4所述的利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S2.2中扩增T7promoter-asap1a-gRNA引物序列为SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示序列。


7.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S3将asap1a-gRNA和Cas9mRNA导入斑马鱼中制备F0代斑马鱼，并鉴定asap1a-gRNA靶位点打靶效率，具体为：
S3.1将体外转录获得的asap1a-gRNA与Cas9mRNA混合后通过显微注射导入...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔佳，吴长新，赵仲华，
申请(专利权)人：山西大学，长治医学院，
类型：发明
国别省市：山西;14