使用截短的引导RNA(tru-gRNA)提高RNA引导的基因组编辑的特异性制造技术

CRISPR‑Cas基因组编辑使用引导RNA将Cas9核酸酶导向靶DNA，所述引导RNA包括通过碱基配对结合靶DNA的互补区和Cas9结合区。还公开了通过使用截短的引导RNA(tru‑gRNA)，使用CRISPR/Cas9系统提高RNA引导的基因组编辑的特异性的方法。

Using truncated guide RNA (tru gRNA) to improve the specificity of RNA guided genome editing

CRISPR \u2011 CAS genome editing uses guiding RNA to guide cas9 nuclease to target DNA, which includes complementary regions and cas9 binding regions that bind target DNA through base pairing. Also disclosed is a method for improving the specificity of RNA guided genome editing by using truncated guide RNA (tru \u2011 gRNA) and CRISPR / cas9 system.

【技术实现步骤摘要】
使用截短的引导RNA(tru-gRNA)提高RNA引导的基因组编辑的特异性本专利技术是基于申请日为2014年3月14日，申请号为“201480026133.4”(国际申请号为PCT/US2014/029068)，专利技术名称为“使用截短的引导RNA(tru-gRNA)提高RNA引导的基因组编辑的特异性”的专利申请的分案申请。优先权申明本申请要求2013年3月15日提交的美国专利申请系列第61/799,647号、2013年6月21日提交的美国专利申请系列第61/838,178号、2013年6月21日提交的美国专利申请系列第61/838,148号和2013年12月26日提交的美国专利申请系列第61/921,007号的权益。前述专利申请系列号的完整内容在此通过引用并入。联邦资助的研究或开发本专利技术是在由美国国家卫生研究院授予的基金第DP1GM105378号下借助政府资助进行的。政府具有本专利技术的某些权利。
用于提高RNA引导的基因组编辑(例如使用CRISPR/Cas9系统，使用截短的引导RNA(tru-gRNA)编辑)的特异性的方法。背景最近的工作已显示成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR-相关(Cas)系统(Wiedenheft等，Nature482，331-338(2012)；Horvath等，Science327，167-170(2010)；Terns等，CurrOpinMicrobiol14，321-327(2011))可用作在细菌、酵母和人细胞中以及在体内在完整生物体诸如果果蝇、斑马鱼和小鼠中进行基因组编辑的基础(Wang等，Cell153，910-918(2013)；Shen等，CellRes(2013)；Dicarlo等，NucleicAcidsRes(2013)；Jiang等，NatBiotechnol31，233-239(2013)；Jinek等，Elife2，e00471(2013)；Hwang等，NatBiotechnol31，227-229(2013)；Cong等，Science339，819-823(2013)；Mali等，Science339，823-826(2013c)；Cho等，NatBiotechnol31，230-232(2013)；Gratz等，Genetics194(4)：1029-35(2013))。来自化脓性链球菌(S.pyogenes)的Cas9核酸酶(在下文中简称为Cas9)可通过工程化引导RNA(gRNA)的前20个核苷酸与紧接前间区序列邻近基序(PAM)例如匹配序列NGG或NAG的PAM之后的目标靶基因组DNA序列的互补链之间的碱基对互补序列来引导(Shen等，CellRes(2013)；Dicarlo等，NucleicAcidsRes(2013)；Jiang等，NatBiotechnol31，233-239(2013)；Jinek等，Elife2，e00471(2013)；Hwang等，NatBiotechnol31，227-229(2013)；Cong等，Science339，819-823(2013)；Mali等，Science339，823-826(2013c)；Cho等，NatBiotechnol31，230-232(2013)；Jinek等，Science337，816-821(2012))。在体外(Jinek等，Science337，816-821(2012))于细菌中(Jiang等，NatBiotechnol31，233-239(2013))和人细胞中(Cong等，Science339，819-823(2013))进行的先前研究已显示Cas9-介导的裂解在一些情况下可被gRNA/靶位点交界处上，特别地位于20ntgRNA互补区的3’末端中的最后10-12个核苷酸(nt)中的单个错配消除。概述CRISPR-Cas基因组编辑使用引导RNA，其包括互补区(其通过碱基配对结合靶DNA)和Cas9-结合区，以将Cas9核酸酶导向靶DNA(参见图1)。所述核酸酶可耐受互补区中的许多错配(多达5个，如本文中显示的)并且仍然裂解；难以预测任何给定的单个错配或错配的组合对活性的影响。综上所述，这些核酸酶可显示显著的脱靶效应，但预测这些位点可具有挑战性。本文中描述了用于使用CRISPR/Cas系统，例如使用Cas9或基于Cas9的融合蛋白提高基因组编辑的特异性的方法。具体地，提供包括缩短的靶互补区(即，少于20nt，例如17-19或17-18nt的靶互补序列，例如17、18或19nt的靶互补序列)的截短的引导RNA(tru-gRNA)，及其使用方法。如本文中所用，“17-18或17-19”包括17、18或19个核苷酸。在一个方面，本专利技术提供具有17-18或17-19个核苷酸的靶互补区的引导RNA分子(例如，单一引导RNA或crRNA)，例如，靶互补区由17-18或17-19个核苷酸组成，例如，靶互补区由连续靶互补序列的17-18或17-19个核苷酸组成。在一些实施方案中，引导RNA包括与选定的靶基因组序列的互补链的17-18或17-19个连续核苷酸互补的由17-18或17-19个核苷酸组成的互补区。在一些实施方案中，靶互补区由17-18个核苷酸(靶互补序列的)组成。在一些实施方案中，互补区与选定的靶序列的互补链的17个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，互补区与选定的靶序列的互补链的18个连续核苷酸互补。在另一个方面，本专利技术提供由以下序列组成的核糖核酸：(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUA(SEQIDNO：2404)；(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQIDNO：2407)；或(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQIDNO：2408)；(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(XN)(SEQIDNO：1)；(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(SEQIDNO：2)；(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(SEQIDNO：3)；(X17-18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(XN)(SEQIDNO：4)、(X17-18或X17-19)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQIDNO：5)；(X17-18或X17-19)G本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在细胞中提高RNA引导的基因组编辑的特异性的方法，所述方法包括将所述细胞与引导RNA接触，所述引导RNA包括与选定的靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的由17-18个核苷酸组成的互补区。/n

【技术特征摘要】
20130315 US 61/799,647;20130621 US 61/838,178;20131.一种在细胞中提高RNA引导的基因组编辑的特异性的方法，所述方法包括将所述细胞与引导RNA接触，所述引导RNA包括与选定的靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的由17-18个核苷酸组成的互补区。


2.一种在细胞中诱导双链DNA分子的靶区域中的断裂的方法，所述方法包括在细胞中表达如下物质或将所述物质引入细胞：
Cas9核酸酶或切口酶；和
引导RNA，其包括与双链DNA分子的互补链的17-18个连续核苷酸互补的由17-18个核苷酸组成的互补区。


3.一种在细胞中修饰双链DNA分子的靶区域的方法，所述方法包括在细胞中表达如下物质或将所述物质引入细胞：
dCas9-异源功能性结构域融合蛋白(dCas9-HFD)；和
引导RNA，其包括与选定的靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的由17-18个核苷酸组成的互补区。


4.根据权利要求1-3所述的方法，其中所述引导RNA是：
(i)单一引导RNA，其包括与选定的靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的由17-18个核苷酸组成的互补区，或
(ii)crRNA，其包括与选定的靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的由17-18个核苷酸组成的互补区，以及tracrRNA。


5.根据权利要求1-3所述的方法，其中所述引导RNA是或包含选自由以下组成的组的核糖核酸：
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUA(SEQIDNO:2404)；
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQIDNO:2407)；或
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQIDNO:2408)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(XN)(SEQIDNO:1)、
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(SEQIDNO:2)、
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(SEQIDNO:3)、
(X17-18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(XN)(SEQIDNO:4)、
(X17-18)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQIDNO:5)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQIDNO:6)；或
(X17-18)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQIDNO:7)；
其中X17-18是与选定的靶序列，优选地紧接前间区序列邻近基序(PAM)的5’的靶序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的互补区，并且XN是不干扰所述核糖核酸对Cas9的结合的任意序列，其中N可以是0-200，例如0-100、0-50或0-20。


6.一种引导RNA分子，其具有17-18个核苷酸的靶互补区。


7.根据权利要求6所述的gRNA，其中所述靶互补区由17-18个核苷酸组成。


8.根据权利要求6所述的gRNA，其中所述靶互补区由靶互补序列的17-18个核苷酸组成。


9.根据权利要求6所述的gRNA，其由如下序列组成：
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUA(SEQIDNO:2404)；
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQIDNO:2407)；或
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQIDNO:2408)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(XN)(SEQIDNO:1)、
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(SEQIDNO:2)、
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(SEQIDNO:3)、
(X17-18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(XN)(SEQIDNO:4)、
(X17-18)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQIDNO:5)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：JK乔昂格，JD桑德，Y付，M梅德，
申请(专利权)人：通用医疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US