一种抗菌物质Bovisin及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开了一种抗菌物质Bovisin，其分子量为910Da，由6个氨基酸残基和1个17‑胍基‑3‑羟基十五烷酸组成。Bovisin对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特杆菌和枯草芽孢杆菌都具有显著的抑菌作用，并且具有良好的稳定性，在不同的pH值环境下抑菌效果稳定，在肠道中不易失活，具有较好的应用前景。此外，还提供了Bovisin的制备方法，首次采用牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333，以麸皮培养基作为培养介质进行发酵，并经过离心、萃取，凝胶柱分离、HPLC纯化，冷冻干燥，制备得到抗菌物质Bovisin，披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵麸皮培养基生成抗菌物质Bovisin的新用途，拓宽了抗菌物质的来源和种类。

【技术实现步骤摘要】
一种抗菌物质Bovisin及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种抗菌物质Bovisin；此外还涉及一种抗菌物质Bovisin的制备方法。
技术介绍
抗生素(antibiotic)是抗菌物质中具有代表性的一类，它由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。抗生素的特点有：(1)直接作用于菌体细胞。抗生素能选择性地作用于菌体细胞DNA、RNA和蛋白质合成系统的特定环节，干扰细胞的代谢作用，妨碍生命活动或使停止生长，甚至死亡。(2)具有选择性抗生谱。不同抗生素对不同病原菌的作用不一样，对某种抗生素敏感的病原菌种类称为该抗生素的抗生谱(抗菌谱)，这一点不同于无选择性的普通消毒剂或杀菌剂。(3)有效作用浓度低。各种抗生素一般都在很低浓度下对病原菌就发生作用，这是抗生素区别于其他化学杀菌剂的又一主要特点。各种抗生素对不同微生物的有效浓度各异，通常以抑制微生物生长的最低浓度作为抗生素的抗菌强度，简称有效浓度。有效浓度越低，表明抗菌作用越强。中国专利申请CN103740618A公开了类芽孢杆菌属的一个新菌种(后被定名为牛类芽孢杆菌，Paenibacillusbovis)，并将其中的模式菌株BD3526于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该菌株的保藏编号为：CGMCCNo.8333，该菌株的菌落非常粘稠，表明该菌株具有高产胞外多糖的生理特性。此外，中国专利申请CN104757544A和CN104762350A公开了该菌株具有代谢天然培养基产抑菌性物质的能力及其应用，但并未揭示代谢产物中发挥抑菌作用的明确组分。尽管现在抗菌物质的品类繁多，但大部分在使用时伴有耐药性、副作用和特异性等消极影响，因此，找到新型抗菌剂是当务之急。其次，从培养基角度来看，大部分的报道采用化学合成培养基作为发酵基料，这将直接影响产品的制备成本和使用安全性。上述这些都是本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现思路
基于上述技术问题，本专利技术提供了一种新型的抗菌物质Bovisin。第一方面，提供了一种抗菌物质Bovisin，分子量为910Da，由6个氨基酸残基和1个17-胍基-3-羟基十五烷酸组成。进一步地，抗菌物质Bovisin的化学结构式如下：第二方面，还提供了第一方面所述的任一种抗菌物质Bovisin的制备方法，包括以下步骤：(a)将牛类芽孢杆菌CGMCCNo.8333接种于麸皮培养基中进行发酵，得到发酵液；(b)将步骤(a)得到的发酵液离心取上清，置于高温水浴中灭活蛋白酶，待冷却后，加入正丁醇萃取，离心取正丁醇相，除去正丁醇，加水溶解，冷冻干燥，得到粗品1；(c)将步骤(b)得到的粗品1通过凝胶柱分离，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到粗品2；(d)将步骤(c)得到的粗品2通过HPLC纯化，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，即得抗菌物质Bovisin。进一步地，上述步骤(a)中，牛类芽孢杆菌CGMCCNo.8333的接种量为1.6x106～8x106cfu/mL。进一步地，上述步骤(a)中，所述麸皮培养基包括麸皮和水，麸皮占麸皮培养基的质量百分比为2～6％。进一步地，上述步骤(a)中，发酵为振荡培养，振荡速度为100～300rpm。进一步地，上述步骤(a)中，发酵的温度为25℃～35℃。进一步地，上述步骤(a)中，发酵的时间为48～96h。进一步地，上述步骤(b)中，离心的速度为6,000～10,000g，离心的时间为10～20分钟。进一步地，上述步骤(b)中，高温水浴的温度为60～80℃，保温时间为10～30分钟。进一步地，上述步骤(b)中，正丁醇加入量为发酵液体积的0.5～2倍，萃取次数为3～5次，每次萃取静置的时间为8～16h。进一步地，上述步骤(c)中，凝胶柱为LH20凝胶柱，规格为D2.6cm×30cm，分离条件包括：以体积比为3的甲醇-水溶液进行等度洗脱，洗脱速度为2mL/min，洗脱液的收集速度为2.5min/管。进一步地，上述步骤(d)中，HPLC采用的色谱柱为C18柱，规格为SunfireC18柱，20mm×250mm，粒径5μm，分离条件包括：以含0.1％TFA的水为A相，含0.1％TFA的乙腈为B相，进行梯度洗脱，洗脱速度为4mL/min，洗脱液的收集速度为1.5min/管。进一步地，上述步骤(d)中，收集保留时间在32.14min的组分，得到Bovisin。上述技术方案中的抗菌物质Bovisin对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特杆菌和枯草芽孢杆菌都具有显著的抑菌作用，并且具有良好的热稳定性，在不同的pH值环境下抑菌效果稳定，在肠道中不易失活，具有较好的应用前景。生物材料保藏信息：本专利技术提供的类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)BD3526菌株，已于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCCNo.8333。附图说明图1为本专利技术实施例1中粗品1在LH20凝胶柱上的分离效果。图2为本专利技术实施例1中粗品1在LH20凝胶柱上分离后点种法检测抑菌活性的效果。图3为本专利技术实施例1中粗品2在HPLC上的纯化效果。图4为本专利技术实施例1中抗菌物质Bovisin的ESI-MS图谱。图5为本专利技术实施例1中抗菌物质Bovisin的二级质谱图。图6为本专利技术实施例1中抗菌物质Bovisin的氨基酸分析图。具体实施方式为更清楚的对本专利技术技术方案予以阐述，下面将结合具体实施方式对本专利技术的技术方案进行进一步阐述：在面临“如何提供一种新的抗菌剂”这一技术问题时，专利技术人经过创造性劳动，提供一种新的抗菌物质Bovisin，分子量为910Da，由6个氨基酸残基和1个17-胍基-3-羟基十五烷酸组成。通过效果实施例1-4可见，Bovisin对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特杆菌和枯草芽孢杆菌都具有显著的抑菌作用，并且具有良好的稳定性，在不同的pH值环境下抑菌效果稳定，在肠道中不易失活，具有较好的应用前景。具体地，抗菌物质Bovisin的结构式如下所示：在一个具体的实施方式中，提供了一种抗菌物质Bovisin的制备方法，包括以下步骤：(a)将牛类芽孢杆菌(Paenibacillusbovis)CGMCCNo.8333接种于麸皮培养基中进行发酵，得到发酵液；(b)将步骤(a)得到的发酵液离心取上清，置于高温水浴中灭活蛋白酶，待冷却后，加入正丁醇萃取，离心取正丁醇相，除去正丁醇，加水溶解，冷冻干燥，得到粗品1；(c)将步骤(b)得到的粗品1通过凝胶柱分离，收集、检测、合并抑菌活性组分，冷冻干燥，得到粗品2；(d)将步骤(c)得到的粗品2通过HPLC纯化，收集、检测、合并抑菌活性组分，冷冻干燥，得到抗菌物质Bovisin。上述技术方案中的制备方法，首次采用牛类芽孢杆菌(Paenibacillusbovis)CGMCCNo.8333，以麸皮培养基作为培养介质进行发酵，并经过离心、萃取，凝胶柱分离、HPLC纯化，冷冻干燥，制备得到抗菌物质Bovisin，披露本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌物质Bovisin，其特征在于，分子量为910Da，由6个氨基酸残基和1个17‑胍基‑3‑羟基十五烷酸组成。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌物质Bovisin，其特征在于，分子量为910Da，由6个氨基酸残基和1个17-胍基-3-羟基十五烷酸组成。2.根据权利要求1所述的抗菌物质Bovisin，其特征在于，其化学结构式如下：3.一种权利要求1或2所述的抗菌物质Bovisin的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)将牛类芽孢杆菌CGMCCNo.8333接种于麸皮培养基中进行发酵，得到发酵液；(b)将步骤(a)得到的发酵液离心取上清，置于高温水浴中灭活蛋白酶，待冷却后，加入正丁醇萃取，离心取正丁醇相，除去正丁醇，加水溶解，冷冻干燥，得到粗品1；(c)将步骤(b)得到的粗品1通过凝胶柱分离，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到粗品2；(d)将步骤(c)得到的粗品2通过HPLC纯化，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到抗菌物质Bovisin。4.根据权利要求3所述的抗菌物质Bovisin的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述牛类芽孢杆菌CGMCCNo.8333的接种量为1.6x106～8x106cfu/mL。5.根据权利要求3所述的抗菌物质Bovisin的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述麸皮培养基包括麸皮和水，麸皮占麸皮培养基的质量百分比为2～6％。6.根据权利要求3所述的抗菌物质Bovisin的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述发酵为振荡培养，振荡速度为100～300rpm；所述发酵的温度为25℃～35℃；所述发酵的时...

【专利技术属性】
技术研发人员：花榜清，韩瑨，吴正钧，冯华峰，高彩霞，
申请(专利权)人：光明乳业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31