结直肠癌相关疾病的生物标志物制造技术

本发明专利技术提供了用于预测与微生物相关的疾病(特别是结直肠癌和结直肠中的进展性腺癌)的风险的生物标志物和方法。

Biomarkers of colorectal cancer related diseases

The present invention provides biomarkers and methods for predicting the risks associated with microbial diseases (especially colorectal cancer and progression of adenocarcinoma in colorectal).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】结直肠癌相关疾病的生物标志物相关申请的交叉引用无领域本专利技术涉及用于预测与微生物相关的疾病，特别是结直肠癌和结直肠中的进展性腺瘤的风险的生物标志物和方法。背景结直肠癌(CRC)是全球前三位最常诊断的癌症之一，是癌症死亡的主要原因。其在较发达国家的发病率较高，但在诸如东亚、西班牙和东欧等历史低风险地区，由于所谓的西方生活方式，发病率正在迅速上升。在结直肠癌的发展中，遗传学改变累积了多年，通常涉及肿瘤抑制基因腺瘤性结肠息肉病基因(APC)的丧失，以及随后分别发生在KRAS、PIK3CA和TP53中的激活或失活突变(Brenner,H.,Kloor,M.&Pox,C.P.Colorectalcancer.Lancet383,1490-502(2014)，通过引用并入本文)。虽然大多数CRC病例是散发性的，但在其出现之前通常发生异常腺瘤，该异常腺瘤可进展为恶性形式，这称为腺瘤-癌顺序。结直肠腺瘤和结直肠癌的早期诊断不仅有助于防止死亡，而且也有助于降低手术干预的费用。CRC是研究最多的与肠道微生物群相关的疾病之一。然而，该疾病的因果关系通常通过施用抗生素混合剂疗法来研究，所述抗生素混合剂疗法清除肠道微生物群而无法获知起作用的确切微生物菌株和基因。相比于正常结肠组织，在结直肠癌中检测到了梭杆菌属(Fusobacterium)，并且发现其富集在腺瘤中。具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)(一种牙周病病原体)，被发现能够促进ApcMin/+小鼠中肠道肿瘤的骨髓浸润，并与小鼠和人中的促炎基因诸如Ptgs2(COX-2)、Scyb1(IL8)、Il6、Tnf(TNFα)和Mmp3的表达上调相关(Kostic,A.D.等,Fusobacteriumnucleatumpotentiatesintestinaltumorigenesisandmodulatesthetumor-immunemicroenvironment.CellHostMicrobe14,207-215(2013)，通过引用并入本文)。然而，目前尚不清楚，是否有更多的细菌或古细菌可作为结直肠癌病因的标志物或促成病因。目前CRC的检测，诸如可屈性乙状结肠镜检查和结肠镜检查，都是侵入性的，并且患者可能会在该检测过程和肠道准备过程中感到不舒服或不愉快。肠道微生物群与免疫系统之间的相互作用在肠内和肠外的许多疾病中具有重要作用(Cho,I.&Blaser,M.J.Thehumanmicrobiome:attheinterfaceofhealthanddisease.NatureRev.Genet.13,260-270(2012)，通过引用并入本文)。粪便DNA的肠道微生物群分析有潜力被用作无创性检测，以发现可用作CRC患者早期诊断的筛选工具的特异性生物标志物，从而获得更长的生存时间和更好的生活质量。概要本公开内容的实施方案旨在至少一定程度地解决现有技术中存在的至少一个问题。本专利技术基于专利技术人的以下发现：肠道微生物群的评估和表征已成为人类疾病(包括结直肠癌)的主要研究领域。本专利技术人首次针对来自健康对照、结直肠癌和腺瘤患者的粪便样品进行宏基因组全基因组鸟枪法测序。为了对结直肠癌和腺瘤患者中的肠道微生物含量进行分析，本专利技术人进行了宏基因组关联分析(Metagenome-WideAssociationStudy)(MGWAS)方案(Qin,J.等Ametagenome-wideassociationstudyofgutmicrobiotaintype2diabetes.Nature490,55-60(2012)，通过引用并入本文)。为了比较健康对照组、进展性腺瘤组和癌症患者组的粪便微生物群系，鉴定了相对丰度在任意两组之间展现出显著差异的基因(p<0.05，Kruskal-Wallis检验)。随后根据其在所有样品中的丰度变化，这些标记基因被聚类形成MLG(宏基因组连锁群)(Qin等，2012，同上)，并且本专利技术人鉴定了这些肿瘤的MLG特征。然后本专利技术人鉴定并验证了15个用于结直肠癌的早期和无创性诊断的MLG，以及10个用于结直肠腺瘤的早期和无创性诊断的MLG。为了利用这些基于肠道微生物群的CRC分类的潜力，本专利技术人通过分别基于15个MLG和10个MLG的随机森林模型计算了疾病的概率。本专利技术人的数据为表征与CRC风险相关的肠道宏基因组提供了具有洞察力的见解，也为以后研究肠道宏基因组在其它相关病症的病理生理学中的作用提供了一个范例，同时还揭示了基于肠道-微生物群的方法用于评估处于此类病症风险中的个体的潜在用途。据信，上述15个MLG和10个MLG对于改善CRC的早期检测具有重要价值，原因如下。第一，与常规标志物相比，本专利技术的标志物更特异和灵敏。第二，粪便分析具备准确性、安全性、经济可承受性和患者依从性。粪便样品是可运输的。与需要肠道制备的结肠镜检查相比，本专利技术涉及舒适且无创的体外方法，因此人们更容易参与给定的筛查程序。第三，本专利技术的标志物也可用作CRC患者的治疗监测工具，以检测对治疗的反应。因此，在第一方面，本专利技术提供了用于在受试者中预测或诊断与微生物群相关的疾病或确定受试者是否具有形成所述疾病的风险的生物标志物组。在第二方面，本专利技术提供了用于在受试者中预测或诊断与微生物群相关的疾病，或确定受试者是否具有形成所述疾病的风险的试剂盒，其包含用于测定样品中的本专利技术的生物标志物组的每种生物标志物的水平或其量的试剂。在第三方面，本专利技术提供了用于测定本专利技术的生物标志物组的每种生物标志物的水平或其量的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于在受试者中预测或诊断与微生物群相关的疾病或用于确定受试者是否具有形成所述疾病的风险。在第四方面，本专利技术提供了用于在受试者中预测或诊断与微生物群相关的疾病或确定受试者是否具有形成所述疾病的风险的方法。附图说明根据以下描述，并结合附图，本公开内容的各个方面及优点将变得明显并且易于理解，其中：图1示出了肠道MLG能够将结直肠癌样品与健康对照样品进行分类。(a)随着MLG数量的增加，癌的随机森林分类中5次10折交叉验证的误差的分布情况。使用MLG(>100个基因)在对照和癌症样品(n＝55和41)中的相对丰度训练该模型。黑色曲线表示5次验证的平均值(灰线)。黑色直线标示最优集中的MLG数目(15个MLG)(表2-1，表2-2)。即使将年龄和BMI因素与MLG一起考虑，仍然筛选得到相同的MLG。(b)根据(a)中的模型的交叉验证训练集中的癌的概率的盒须图(box-and-whiskerplot)。(c)训练集的接受者工作曲线(ROC)。在临界值(cut-off)为0.5时，AUC为98.34％，95％的置信区间(CI)为96.29-100％。(d)由8个对照样品(黑色方块)、47个进展性腺瘤样品(空心圆)和5个癌症样品(实心黑圈)组成的测试集的分类结果。(e)测试集的ROC。在临界值为0.5时，AUC为96％，95％的CI为87.88-100％。如果癌的概率≥0.5，则该受试者处于患结直肠癌的风险中。图1的结果表明，上述15个MLG可用作诊断结直肠癌和/或确定患结直肠癌的风险的生物标志物，且本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在受试者中预测或诊断与微生物群相关的疾病或确定受试者是否具有形成所述疾病的风险的生物标志物组，其包含以下生物标志物：(1)MLG 317或其一个或多个特异性片段，所述MLG 317由SEQ ID NO：933‑1052组成；(2)MLG 3770或其一个或多个特异性片段，所述MLG 3770由SEQ ID NO：1053‑1281组成；和(3)MLG 3840或其一个或多个特异性片段，所述MLG 3840由SEQ ID NO：238‑639组成；任选地，所述生物标志物组还包含以下生物标志物中的一种或多种：(4)MLG 665或其一个或多个特异性片段，所述MLG 665由SEQ ID NO：640‑932组成；(5)MLG 721或其一个或多个特异性片段，所述MLG 721由SEQ ID NO：120‑237组成；(6)MLG 1738或其一个或多个特异性片段，所述MLG 1738由SEQ ID NO：1471‑2436组成；(7)MLG 1340或其一个或多个特异性片段，所述MLG 1340由SEQ ID NO：2893‑3067组成；(8)MLG 5954或其一个或多个特异性片段，所述MLG 5954由SEQ ID NO：1‑119组成；(9)MLG 711或其一个或多个特异性片段，所述MLG 711由SEQ ID NO：1282‑1470组成；和(10)MLG 4668或其一个或多个特异性片段，所述MLG 4668由SEQ ID NO：2437‑2892组成；优选地，所述生物标志物组包含如(1)‑(8)中定义的生物标志物。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于在受试者中预测或诊断与微生物群相关的疾病或确定受试者是否具有形成所述疾病的风险的生物标志物组，其包含以下生物标志物：(1)MLG317或其一个或多个特异性片段，所述MLG317由SEQIDNO：933-1052组成；(2)MLG3770或其一个或多个特异性片段，所述MLG3770由SEQIDNO：1053-1281组成；和(3)MLG3840或其一个或多个特异性片段，所述MLG3840由SEQIDNO：238-639组成；任选地，所述生物标志物组还包含以下生物标志物中的一种或多种：(4)MLG665或其一个或多个特异性片段，所述MLG665由SEQIDNO：640-932组成；(5)MLG721或其一个或多个特异性片段，所述MLG721由SEQIDNO：120-237组成；(6)MLG1738或其一个或多个特异性片段，所述MLG1738由SEQIDNO：1471-2436组成；(7)MLG1340或其一个或多个特异性片段，所述MLG1340由SEQIDNO：2893-3067组成；(8)MLG5954或其一个或多个特异性片段，所述MLG5954由SEQIDNO：1-119组成；(9)MLG711或其一个或多个特异性片段，所述MLG711由SEQIDNO：1282-1470组成；和(10)MLG4668或其一个或多个特异性片段，所述MLG4668由SEQIDNO：2437-2892组成；优选地，所述生物标志物组包含如(1)-(8)中定义的生物标志物。2.权利要求1的生物标志物组，其中所述特异性片段的长度为至少30bp，或至少40bp，或至少50bp，或至少60bp，或至少70bp，或至少80bp，或至少90bp，或至少100bp，或至少150bp，或至少200bp，或至少250bp，或至少300bp，或至少350bp，或至少400bp，或至少450bp，或至少500bp，或至少600bp，或至少700bp，或至少800bp，或至少900bp，或至少1000bp，或至少1500bp，或至少2000bp。3.权利要求1或2的生物标志物组，其特征还在于以下项中的任一项或多项：(1)所述MLG5954的一个或多个特异性片段选自SEQIDNO：1-119或其任意组合；(2)所述MLG721的一个或多个特异性片段选自SEQIDNO：120-237或其任意组合；(3)所述MLG3840的一个或多个特异性片段选自SEQIDNO：238-639或其任意组合；(4)所述MLG665的一个或多个特异性片段选自SEQIDNO：640-932或其任意组合；(5)所述MLG317的一个或多个特异性片段选自SEQIDNO：933-1052或其任意组合；(6)所述MLG3770的一个或多个特异性片段选自SEQIDNO：1053-1281或其任意组合；(7)所述MLG711的一个或多个特异性片段选自SEQIDNO：1282-1470或其任意组合；(8)所述MLG1738的一个或多个特异性片段选自SEQIDNO：1471-2436或其任意组合；(9)所述MLG4668的一个或多个特异性片段选自SEQIDNO：2437-2892或其任意组合；和(10)所述MLG1340的一个或多个特异性片段选自SEQIDNO：2893-3067或其任意组合。4.权利要求1-3中任一项的生物标志物组，其中所述疾病是结直肠中的进展性腺瘤。5.权利要求1-4中任一项的生物标志物组，其中所述受试者是哺乳动物，诸如灵长类动物，优选为人。6.权利要求1-5中任一项的生物标志物组，其中所述生物标志物组用于区分患有进展性腺瘤的患者与健康受试者。7.一种用于在受试者中预测或诊断与微生物群相关的疾病，或确定受试者是否具有形成所述疾病的风险的试剂盒，其包含用于测定权利要求1-6中任一项的生物标志物组的每种生物标志物在样品中的水平或其量的试剂。8.权利要求7的试剂盒，其中所述试剂选自：(a)引物组，其包含：(a1)能够特异性扩增MLG317或其一个或多个特异性片段的一种或多种引物，所述MLG317由SEQIDNO：933-1052组成；(a2)能够特异性扩增MLG3770或其一个或多个特异性片段的一种或多种引物，所述MLG3770由SEQIDNO：1053-1281组成；和(a3)能够特异性扩增MLG3840或其一个或多个特异性片段的一种或多种引物，所述MLG3840由SEQIDNO：238-639组成；任选地，所述引物组还包含以下引物的一种或多种：(a4)能够特异性扩增MLG665或其一个或多个特异性片段的一种或多种引物，所述MLG665由SEQIDNO：640-932组成；(a5)能够特异性扩增MLG721或其一个或多个特异性片段的一种或多种引物，所述MLG721由SEQIDNO：120-237组成；(a6)能够特异性扩增MLG1738或其一个或多个特异性片段的一种或多种引物，所述MLG1738由SEQIDNO：1471-2436组成；(a7)能够特异性扩增MLG1340或其一个或多个特异性片段的一种或多种引物，所述MLG1340由SEQIDNO：2893-3067组成；(a8)能够特异性扩增MLG5954或其一个或多个特异性片段的一种或多种引物，所述MLG5954由SEQIDNO：1-119组成；(a9)能够特异性扩增MLG711或其一个或多个特异性片段的一种或多种引物，所述MLG711由SEQIDNO：1282-1470组成；和(a10)能够特异性扩增MLG4668或其一个或多个特异性片段的一种或多种引物，所述MLG4668由SEQIDNO：2437-2892组成；优选地，所述引物组包含如(a1)-(a8)中定义的引物；(b)探针组，其包含：(b1)能够与MLG317或其一个或多个特异性片段特异性杂交的一种或多种探针，所述MLG317由SEQIDNO：933-1052组成；(b2)能够与MLG3770或其一个或多个特异性片段特异性杂交的一种或多种探针，所述MLG3770由SEQIDNO：1053-1281组成；和(b3)能够与MLG3840或其一个或多个特异性片段特异性杂交的一种或多种探针，所述MLG3840由SEQIDNO：238-639组成；任选地，所述探针组还包含以下探针的一种或多种：(b4)能够与M...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯强，梁穗莎，贾慧珏，王俊，
申请(专利权)人：深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44