泡状引物制造技术

描述了用于产生核苷酸序列的序列即用片段的方法，该方法利用“泡状引物”，所述泡状引物包括与靶杂交的第一部分和第三部分以及形成未杂交环的部分地自身互补的第二部分。该环包含允许使用测序引物的通用序列。第一部分可以是可降解的，以便产生具有两侧是第三部分和第二部分的通用序列的感兴趣序列的扩增子。在优选的实施方案中，第二部分或第二部分和第三部分之间的区域还包括核苷酸A、C、G、T的四联体(tetrad)，允许校准测序反应。

Vesicular primers

For sequence nucleotide sequence with fragment method is described, the method using the \bubble primer\, the bubble self complementary primers include second parts: the first part and the third part hybridization with target and partially formed without hybrid ring. The ring contains a universal sequence that allows the use of sequenced primers. The first portion can be degradable to produce an amplified sequence of interest sequences having a universal sequence of third parts and second parts on both sides. In preferred embodiments, the regions between the second or second and third portions also include nucleotide, C, G, and T four conjoined (tetrad), allowing calibration of the sequencing reaction.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】泡状引物专利
本专利技术涉及从起始模板生成可用于DNA测序分析的多核苷酸片段的方法。这些片段在下一代测序方法中有用。本专利技术的多个方面涉及在该方法中使用的核酸引物。专利技术背景自从完成人类基因组序列草案以来，DNA测序分析的生物化学和仪器已经进展到这样的点：对于原始基因组消耗的相同财务支出，现在(2014)对大都市芝加哥(人口270万)中每个男人、女人和儿童以每设备每29小时一个完整基因组的速度产生基因组序列是可能的，每个基因组的每个和每一个区域被30倍覆盖。这种惊人的能力增加是由以通用的方式处理所有被测序的DNA片段的能力造成的，基因组的每个部分被同时暴露于相同的生物化学。“大规模平行”DNA测序通过基因组DNA的随机片段化，然后将人工序列“连接子(adapter)”酶促连接到片段化的DNA小片的每一端来实现。从基因组DNA生成测序“库”是耗时的，而且由于两个不同“风格”的连接子的连接的随机性质，产生其中约一半的模板事实上不可用于分析的片段：许多产物将具有相同的“A型”或“B型”连接子连接在片段的末端，而所需要的是偶然发生的不对称连接，一个风格的连接子(A型)在一个末端而另一个风格的连接子(B型)在另一个末端。一旦开始测序反应，这些不对称产物能够从基因组模板被克隆扩增，并理想地用于生成有价值的序列信息。目前用于NGS的测序文库的制备技术包括以下步骤：·模板DNA的随机片段化·具有所需长度的那些片段的尺寸选择·对片段末端的酶促“末端修复”以允许A型和B型连接子的平端连接·连接子的连接，产生一部分“A/A”和“B/B”冗余产物以及“A/B”所需产物群·连接子修饰的文库片段的克隆扩增。随着基因组重新测序成本降低和测序的速度增加，NGS的应用越来越多地转向临床。然而，很少存在这样的情况，其中读取基因组的全部320万个碱基是有重大关系的；可能的是更有针对性的方法是有实用性的，通过研究与具体状况相关(或可能确认具体状况)的有限数量的遗传位置指导治疗。如果不必读取基因组的全部碱基，那么伴随的是，应用仅为了实现读取基因组的全部碱基的技术和方法学可能不是最佳的。具体区域的靶向测序最有效地要求从可能极度多样化和复杂的主体模板中分离那些序列。有效地，这可以通过将靶区域扩增至它们的数量超过其它未扩增区域的数量的水平来实现。此类扩增产物将可用于NGS末端连接子的那种连接(如以上所述的)，但这些将再次成为混合群体，在该混合群体中很大比例的序列将是不适合支持NGS测序的克隆扩增的“A/A”和“B/B”形式。关键的是，甚至是那些A/B型的构建体也会具有存在于插入在连接子序列和目标是用于测序的基因组DNA的区域之间的大的“引物残留物”区域。如果连接子序列提供测序引物的结合位点，那么这些引物残留物将是产生的第一数据：不必要且不能提供信息的。已知序列的大量区域必须在到达感兴趣的未知序列之前通过NGS法处理。这不仅使用不必要的资源，而且通常测序方法在接近读段起始处最准确，导致之后的未知序列以较低的保真性被读取。能够产生具有较短的已知区域的序列片段，以降低所进行的不必要的测序的量并提高生成的感兴趣的未知序列的保真性将是期望的。基于连接的连接子策略的另一个缺点是需要获得连接子的不对称掺入(即序列片段的每个末端上的连接子不同)。然而，连接反应通常是非定向的，使得只有一部分片段将包括必需的不对称连接子；其他的将在任一端包括相同的连接子。提供一种允许固有地不对称掺入连接子的方法将是期望的。专利技术概述根据本专利技术的第一方面，提供了用于从起始模板多核苷酸生成多核苷酸片段的方法，所述方法包括：a)使用第一引物对从所述起始模板扩增感兴趣的区域以形成掺入所述感兴趣的区域的扩增子，b)用使用第二引物的核酸扩增反应从步骤a)中生成的第一扩增子扩增感兴趣的区域，以形成掺入第二引物的扩增子，其中所述第二引物包括具有第一部分、第二部分和第三部分的核酸序列，所述第一部分与所述起始模板的第一部分互补，所述第二部分与所述起始模板不互补，所述第三部分与所述起始模板的第二部分互补；其中所述起始模板的所述第一和第二部分相邻或彼此紧密靠近；其中所述第二引物的所述第一、第二和第三部分以从5’到3’的顺序布置，使得在与所述起始模板杂交时，所述引物的所述第二部分保持不杂交并且在所述第一和第三部分之间形成环；从而生成包括两侧为所述第二引物的序列的感兴趣的区域的扩增产物。由此生成的扩增产物包括第二引物的部分，并且所述方法因此可用于生成掺入已知序列的扩增子，所述已知序列可用于测序反应(即产物是“测序即用的”)。优选地，步骤b)的扩增反应用第二引物对进行，所述第二引物对的每一个是所述第二引物的形式。以此方式，扩增产物在每个末端包括引物序列。第二引物的第二部分可以包括通用序列，例如，与测序引物序列至少基本上相同的序列。此通用序列可以是许多或所有可能的第二引物共有的，从而允许扩增子被用于测序反应。通用序列还可以与包括四种核苷酸碱基A、C、G和T的每一个的序列相邻。这可以是四种核苷酸的简单四联体(tetrad)(例如ATCG)或可以包括两个、三个或更多个每个碱基(例如，AACCTTGG)。核苷酸可以是任何顺序。该序列可以将通用序列与引物的第三部分隔开。优选地，所述第二引物或每个第二引物的第一和第二部分的至少一部分是降解易感的，而该引物的至少第三部分和第二部分的至少一部分是降解不易感的；并且所述方法还包括步骤：c)将所述引物或每个引物的易感部分从所述扩增子降解下来。这去除了扩增子中的已知序列的区域并且防止残留在扩增子中的第二引物的第二部分再形成茎(当存在茎环结构时)。该茎的再形成否则可以阻止接近另外的引物或引物对的3’末端处的该引物或引物对预期的引物结合位点。所述方法还可包括以下步骤：d)用第三引物或引物对扩增b)的产物和/或c)的产物，该第三引物或每个第三引物包括与所述第二引物或每个第二引物的至少一部分基本上相同(并且优选地相同)的3’核酸序列。优选地，第三引物的基本上相同的核酸序列与所述第二引物或每个第二引物的未降解的非易感部分基本上相同，从而生成包括感兴趣的区域和所述第二引物或每个第二引物的未降解部分的扩增产物。该基本上相同的部分可以与包含于第二引物的第二部分内的通用序列基本上相同。此方法解决了现有技术方法固有的困难。特别地，第二引物或引物对(因为在杂交时形成环或泡而被称为“泡状引物”)可以掺入两个具有已知但变化的序列的区域(与靶互补，并因此根据靶变化)和不与靶互补的固定序列的区域。固定序列可以被用于向扩增区域引入测序连接子或其他有用的序列而不需要连接反应。固定序列可以是人工序列，或衍生自另一生物体的不与模板互补的序列。在优选的实施方案中，固定序列可以包括通用序列，例如测序引物序列。当一个部分或序列被描述为与靶或另一序列“不基本上相同”，优选地该部分或序列与该靶或其他序列不相似，使得该部分或序列在扩增反应中使用的条件下不与和靶互补的序列杂交。相似地，当一个序列与靶“不互补”时，其足够地不相似到使得其在扩增反应中使用的条件下不与靶杂交。“对降解易感”的部分在本文中还可以被称为“可降解的部分”，而对所述降解不易感的部分在本文中可以被称为“耐受部分”。这些术语被互换使用。模板可以是基因组多核苷酸。模本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从起始模板多核苷酸生成多核苷酸片段的方法，所述方法包括：a)使用第一引物对从所述起始模板扩增感兴趣的区域以形成掺入所述感兴趣的区域的扩增子，b)用使用第二引物的核酸扩增反应从步骤a)中生成的第一扩增子扩增所述感兴趣的区域，以形成掺入所述第二引物的扩增子，其中所述第二引物包括具有第一部分、第二部分和第三部分的核酸序列，所述第一部分与所述起始模板的第一部分互补，所述第二部分与所述起始模板不互补，且所述第三部分与所述起始模板的第二部分互补；其中所述起始模板的所述第一和第二部分相邻或彼此紧密靠近；其中所述第二引物的所述第一、第二和第三部分以从5’到3’的顺序布置，使得在与所述起始模板杂交时，所述引物的所述第二部分保持不杂交并且在所述第一和第三部分之间形成环；从而生成包括两侧为所述第二引物的序列的感兴趣的区域的扩增产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.22 GB 1422982.71.一种用于从起始模板多核苷酸生成多核苷酸片段的方法，所述方法包括：a)使用第一引物对从所述起始模板扩增感兴趣的区域以形成掺入所述感兴趣的区域的扩增子，b)用使用第二引物的核酸扩增反应从步骤a)中生成的第一扩增子扩增所述感兴趣的区域，以形成掺入所述第二引物的扩增子，其中所述第二引物包括具有第一部分、第二部分和第三部分的核酸序列，所述第一部分与所述起始模板的第一部分互补，所述第二部分与所述起始模板不互补，且所述第三部分与所述起始模板的第二部分互补；其中所述起始模板的所述第一和第二部分相邻或彼此紧密靠近；其中所述第二引物的所述第一、第二和第三部分以从5’到3’的顺序布置，使得在与所述起始模板杂交时，所述引物的所述第二部分保持不杂交并且在所述第一和第三部分之间形成环；从而生成包括两侧为所述第二引物的序列的感兴趣的区域的扩增产物。2.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)的扩增反应用第二引物对进行，所述第二引物对的每一个引物是所述第二引物的形式。3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第二引物的所述第二部分包括通用序列。4.如权利要求3所述的方法，其中所述通用序列包括测序引物序列。5.如权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述通用序列与所述第二引物的所述第三部分相邻。6.如权利要求5所述的方法，其中所述通用序列通过特定的碱基序列与所述第三部分隔开。7.如权利要求6所述的方法，其中所述通用序列通过以任何特定的顺序包括四种核苷酸碱基A、T、G和C中的每一个的序列与所述第三部分隔开。8.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述第二引物或每个第二引物的所述第一部分的至少一部分是降解易感的，而所述引物的至少所述第三部分和所述第二部分的至少一部分不是降解易感的；并且所述方法还包括步骤c)使所述引物或每个引物的易感部分从所述扩增子降解下来。9.如任一前述权利要求所述的方法，还包括步骤：d)用第三引物对扩增b)的产物和/或c)的产物，每个引物包括与所述第二引物或每个第二引物的所述第二部分的至少一部分基本上相同的核酸序列。10.如权利要求9所述的方法，当从属于权利要求3至7中任一项时，其中b)的产物和/或c)的产物被扩增，并且所述第三引物的核酸序列的至少一部分与所述第二引物或每个第二引物的所述第二部分的所述通用序列基本上相同。11.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述模板是基因组的片段。12.如权利要求11所述的方法，其中所述模板是基因组的基因座。13.如权利要求2所述的方法，其中所述对中的每个第二引物的所述第二部分是不同的。14.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述模板的所述第一和第二部分被0-20个核苷酸隔开，优选地被1-10个核苷酸、更优选地被1-6个核苷酸且最优选地被1、2、3、4、5或6个核苷酸隔开。15.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述第二引物的所述第一部分的长度为最多15、20、25、30、35、50个核苷酸，优选20-35个核苷酸，更优选25个核苷酸。16.如任...

【专利技术属性】
技术研发人员：布莱恩·詹姆斯·麦考恩，卡塔尔·约瑟夫·麦克尔冈，
申请(专利权)人：DNAe集团控股有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB