无酶且无扩增的测序制造技术

本发明专利技术涉及测序探针、方法、试剂盒和装置，其提供具有长读取长度和低误差率的无酶、无扩增和无文库的核酸测序。使用的序列探针包含靶结合域和条形码域；其中所述靶结合域包含至少四个核苷酸，且能够结合靶核酸；其中所述条形码域包含合成主链，所述条形码域包含至少第一附接区域，所述第一附接区域包含能够被第一互补核酸分子结合的核酸序列，且其中所述第一附接区域的所述核酸序列确定由所述靶结合域的第一个核苷酸结合的所述靶核酸的第一核苷酸的位置和身份。

No enzyme and no amplification sequence

The present invention relates to sequencing probes, methods, kits, and devices that provide enzyme free, no amplification, and no library nucleic acid sequencing with long read lengths and low error rates. The use of sequence probe comprises a target binding domain and barcode domain; wherein the target binding domain contains at least four nucleotides, and can bind target nucleic acid; wherein the bar code field contains the synthesis of main chain, bar code domain containing at least a first attachment region, the first attachment region comprising the nucleic acid sequences can be complementary to the first nucleic acid molecules with the first nucleotide of the target nucleic acid first nucleotide and wherein the first attachment region of the nucleic acid sequence determined by the target binding domain with the location and identity.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】无酶且无扩增的测序相关申请的交叉引用本申请要求2014年11月21日提交的美国临时申请号62/082,883的权益。上述专利申请的内容通过引用以其整体并入本文。序列表本申请含有已经经由EFS-Web以ASCII格式提交且在此通过引用以其整体并入的序列表。所述ASCII拷贝，在2015年11月19日生成，被命名为NATE-025_ST25.txt，且大小为20,860字节。专利技术背景目前存在各种核酸测序的方法，即确定核酸分子内核苷酸的精确顺序的方法。目前方法需要酶促地(例如PCR和/或通过克隆)扩增核酸。需要进一步酶促聚合来通过光检测装置产生可检测信号。这种扩增和聚合步骤是昂贵和/或耗时的。因此，本领域需要无扩增和无酶的核酸测序方法。本专利技术解决了这些需求。专利技术概述本专利技术提供测序探针、方法、试剂盒和装置，其提供具有长读取长度和低误差率的无酶、无扩增和无文库的核酸测序。此外，所述方法、试剂盒和装置具有快速的样品至答案（sample-to-answer）能力。这些特征对于在临床环境中的测序特别有用。本文提供了包含靶结合域和条形码域的测序探针。所述靶结合域和条形码域可以可操作地连接，例如共价连接。测序探针任选地包含靶结合域和条形码域之间的间隔物。所述间隔物可以是具有适当机械性能的任何聚合物，例如(1至100个核苷酸，例如2至50个核苷酸的)单链或双链DNA间隔物。双链DNA间隔物的非限制性实例包括SEQIDNO:25至SEQIDNO:29覆盖的序列。所述靶结合域包含至少四个核苷酸(例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个)，并且能够结合靶核酸(例如DNA、RNA和PNA)。所述条形码域包含合成的主链，所述条形码域至少具有包含一个或多个附接区域的第一位置。所述条形码域可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个位置；每个位置具有一个或多个(例如，一个至五十个)附接区域；每个附接区域包含至少一个(即一个至五十个，例如十个至三十个拷贝的核酸序列)能够可逆结合至互补核酸分子(RNA或DNA)。条形码域中的某些位置可具有比其它位置更多的附接区域；可选地，条形码域中的每个位置具有相同数量的附接区域。第一附接区域的核酸序列确定由靶结合域的第一个核苷酸结合的靶核酸中的第一个核苷酸的位置和身份，而第二附接区域的核酸序列确定由靶结合域的第二个核苷酸结合的靶核酸中的第二个核苷酸的位置和身份。同样，第六附接区域的核酸序列确定由靶结合域的第六个核苷酸结合的靶核酸中的第六个核苷酸的位置和身份。在实施方案中，合成的主链包含多糖、多核苷酸(例如单链或双链DNA或RNA)、肽、肽核酸或多肽。靶结合域中的核苷酸数目等于或大于条形码域中的位置数(例如，1、2、3、4或更多)。条形码域的特定位置中的每个附接区域可以包括相同核酸序列的一个拷贝和/或相同核酸序列的多个拷贝。然而，附接区域将包括与条形码域的不同位置的附接区域不同的核酸序列，甚至当两个附接区域都标识相同类型的核苷酸(例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶和其类似物)时。附接区域可以在合成主链中连接至修饰的单体，例如修饰的核苷酸，从而相对于主链产生分支。附接区域可以是合成主链的多核苷酸序列的一部分。一个或多个附接区域可以与至少一个侧接单链多核苷酸相邻，也就是说，附接区域可以可操作地连接至5'侧接单链多核苷酸和/或3'侧接单链多核苷酸。具有或不具有一个或两个侧接单链多核苷酸的附接区域可以与缺乏可检测标记物的杂交核酸分子杂交。缺乏可检测标记物的杂交核酸分子可以长度为约4至约20个核苷酸之间，例如12个核苷酸或更长。附接区域可以由包含可检测标记物的互补核酸结合。每个互补核酸可以包含可检测标记物。可选地，附接区域可以由作为报告复合物的一部分(包含可检测标记物)的互补核酸结合。互补核酸(包含可检测标记物或报告复合物)可以长度为约4至约20个核苷酸之间，例如约8、10、12和14个核苷酸或更多。在报告复合物中，互补核酸与一级核酸分子(直接或间接)连接。互补核酸可以经由单链或双链核酸接头(例如，包含1至100个核苷酸的多核苷酸)间接连接至一级核酸分子。一级核酸与一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)二级核酸杂交。每个二级核酸与一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)三级核酸杂交；三级核酸包含一个或多个可检测标记物。一个或每个二级核酸可以包含不与一级核酸分子杂交且不与三级核酸分子杂交的区域(“额外手柄”)；该区域可以长度为四个或更多个(例如，约6至约40个，例如约8、10、12和14个)核苷酸。不与一级核酸分子杂交并且不与三级核酸分子杂交的区域可以包含与一级核酸分子连接的互补核酸分子的核苷酸序列。该区域可以位于其末端远端的与一级核酸杂交的第二核酸的末端。通过具有包含互补核酸的核苷酸序列的“额外手柄”，报告复合物结合测序探针的可能性和速度大大增加。在本专利技术的任何实施方案或方面中，当报告复合物包含“额外手柄”时，报告复合物可以经由报告复合物的互补核酸或经由“额外手柄”与测序探针杂交。因此，例如，短语“结合第一附接区域...第一报告复合物的第一互补核酸分子”将根据其明确含义理解，并且也被理解为意指“结合第一附接区域...第一报告复合物的“额外手柄”。在实施方案中，术语“条形码域”和“合成主链”是同义的。本文提供了用于使用本专利技术的测序探针对核酸测序的方法。所述方法包括以下步骤：(1)使本专利技术的至少一个测序探针与(例如，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个位置)固定至基质的靶核酸杂交；(2)使具有可检测标记物(例如，荧光标记物)的第一互补核酸分子(RNA或DNA)或包含可检测标记物(例如，荧光标记物)的第一报告复合物的第一互补核酸分子与第一附接区域结合；(3)检测可检测标记物，和(4)鉴定固定的靶核酸中的第一核苷酸的位置和身份。任选地，固定的靶核酸在被探针结合之前是延长的。所述方法还包括以下步骤：(5)使第一附接区域(具有或不具有一个或两个侧接单链多核苷酸)与缺乏可检测标记物的第一杂交核酸分子接触，从而未结合具有可检测标记物的第一互补核酸分子或包含可检测标记物的第一报告复合物的第一互补核酸分子且使缺乏可检测标记物的第一杂交核酸与至少第一附接区域结合；(6)使具有可检测标记物的第二互补核酸分子或包含可检测标记物的第二报告复合物的互补核酸分子与第二附接区域结合；(7)检测可检测标记物；和(8)鉴定固定的靶核酸中的第二核苷酸的位置和身份。重复步骤(5)至(8)，直到已鉴定固定的靶核酸中对应于靶结合域的每个核苷酸。步骤(5)和(6)可以同时或依次发生。每个(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更高)互补核酸分子(具有可检测标记物或报告复合物的一部分)与其相应的(即，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更高)缺乏可检测标记物的杂交核酸分子具有相同的核酸序列。通过用第一和/或第二捕获探针结合靶核酸的第一位置和/或第二位置而将靶核酸固定至基质；每个捕获探针包含选择性结合基质的亲和标签。第一和/或第二位置可以在靶核酸的末端处或附近。所述基质可以是本领域已本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含靶结合域和条形码域的测序探针；其中所述靶结合域包含至少四个核苷酸，并且能够结合靶核酸；其中所述条形码域包含合成主链，所述条形码域包含至少第一附接区域，所述第一附接区域包含能够被第一互补核酸分子结合的核酸序列且其中所述第一附接区域的所述核酸序列确定由所述靶结合域的第一个核苷酸结合的所述靶核酸中的第一个核苷酸的位置和身份。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.21 US 62/0828831.包含靶结合域和条形码域的测序探针；其中所述靶结合域包含至少四个核苷酸，并且能够结合靶核酸；其中所述条形码域包含合成主链，所述条形码域包含至少第一附接区域，所述第一附接区域包含能够被第一互补核酸分子结合的核酸序列且其中所述第一附接区域的所述核酸序列确定由所述靶结合域的第一个核苷酸结合的所述靶核酸中的第一个核苷酸的位置和身份。2.权利要求1的测序探针，其中所述合成主链包含多糖、多核苷酸、肽、肽核酸或多肽。3.权利要求1或权利要求2的测序探针，其中所述合成主链包含单链DNA。4.权利要求1至3中任一项的测序探针，其中所述测序探针在所述靶结合域和所述条形码域之间包含双链DNA间隔物。5.权利要求1至3中任一项的测序探针，其中所述测序探针在所述靶结合域和所述条形码域之间包含与双链DNA具有类似机械性能的基于聚合物的间隔物。6.权利要求4至5中任一项的测序探针，其中所述双链DNA间隔物具有1个碱基对至100个碱基对的长度。7.权利要求4至6中任一项的测序探针，其中所述双链DNA间隔物具有2个碱基对至50个碱基对的长度。8.权利要求1至7中任一项的测序探针，其中所述第一附接区域与至少一个侧接单链多核苷酸相邻。9.权利要求1至8中任一项的测序探针，其中所述第一互补核酸是RNA、DNA或PNA。10.权利要求1至9中任一项的测序探针，其中所述第一互补核酸分子包含可检测标记物。11.权利要求1至9中任一项的测序探针，其中所述靶结合域中的第一核苷酸是修饰的核苷酸或核酸类似物。12.权利要求1至11中任一项的测序探针，其中所述条形码域包含至少第二附接区域，所述第二附接区域包含能够被第二互补核酸分子结合的核酸序列且其中所述第二附接区域的所述核酸序列确定由所述靶结合域的第二个核苷酸结合的所述靶核酸中的第二个核苷酸的位置和身份且其中所述第一互补核酸分子不同于所述第二互补核酸分子。13.权利要求12的测序探针，其中所述第二附接区域与至少一个侧接单链多核苷酸相邻。14.权利要求12的测序探针，其中所述第二互补核酸是RNA、DNA或PNA。15.权利要求14中任一项的测序探针，其中所述第二互补核酸分子包含可检测标记物。16.权利要求12的测序探针，其中所述靶结合域中的第二核苷酸是修饰的核苷酸或核酸类似物。17.权利要求12的测序探针，其中确定所述靶核酸中的第一核苷酸的位置和身份的所述第一附接区域的核酸序列和确定所述靶核酸中的第二核苷酸的位置和身份的所述第二附接区域的核酸序列不同，甚至当所述靶核酸中的第一个核苷酸和所述靶核酸中的第二个核苷酸相同时。18.权利要求1至17中任一项的测序探针，其中所述靶结合域中的核苷酸的数目等于所述条形码域中的附接区域的数目。19.权利要求1至17中任一项的测序探针，其中所述靶结合域中的核苷酸的数目比所述条形码域中的附接区域的数目多至少一个。20.权利要求19的测序探针，其中所述靶结合域中的核苷酸的数目比所述条形码域中的附接区域的数目多至少两个。21.权利要求20的测序探针，其中所述靶结合域中的核苷酸的数目比所述条形码域中的附接区域的数目多至少三个。22.权利要求21的测序探针，其中所述靶结合域中的核苷酸的数目比所述条形码域中的附接区域的数目多至少四个。23.权利要求22的测序探针，其中所述靶结合域中的核苷酸的数目比所述条形码域中的附接区域的数目多至少五个。24.权利要求23的测序探针，其中所述靶结合域中的核苷酸的数目比所述条形码域中的附接区域的数目多至少六个。25.权利要求24的测序探针，其中所述靶结合域中的核苷酸的数目比所述条形码域中的附接区域的数目多至少七个。26.权利要求17的测序探针，其中所述靶结合域包含至少七个核苷酸，并且能够结合所述靶核酸。27.权利要求26的测序探针，其中所述靶结合域中的核苷酸的数目比所述条形码域中的附接区域的数目多至少一个。28.权利要求26的测序探针，其中所述靶结合域包含至少十个核苷酸，并且能够结合所述靶核酸。29.权利要求28的测序探针，其中所述靶结合域中的核苷酸的数目比所述条形码域中的附接区域的数目多至少一个。30.权利要求28的测序探针，其中所述靶结合域包含十个核苷酸，并且所述条形码域包含六个附接区域。31.权利要求1的测序探针，其中所述条形码域包含至少两个第一附接区域，其中所述至少两个第一附接区域包含能够被第一互补核酸分子结合且确定由所述靶结合域的第一个核苷酸结合的靶核酸中的第一个核苷酸的位置和身份的相同核酸序列。32.权利要求31的测序探针，其中条形码域中的每个位置具有相同数目的附接区域。33.权利要求1的测序探针，其中条形码域中的每个位置具有相同数目的附接区域。34.权利要求33的测序探针，其中条形码域中的每个位置具有一个附接区域。35.权利要求33的测序探针，其中条形码域中的每个位置具有多于一个附接区域。36.权利要求1的测序探针，其中条形码域中的至少一个位置具有更大数目的附接区域作为另一位置。37.权利要求1至36中任一项的测序探针，其中所述第一附接区域与所述合成主链中的修饰单体连接。38.权利要求37的测序探针，其中所述修饰的单体是修饰的核苷酸。39.权利要求1至38中任一项的测序探针，其中所述第一附接区域从所述合成主链分支。40.权利要求12的测序探针，其中所述第二附接区域从所述合成主链分支。41.权利要求17的测序探针，其中所述至少六个附接区域中的每一个从所述合成主链分支。42.权利要求1至41中任一项的测序探针，其中所述靶结合域和所述合成主链是可操作地连接的。43.权利要求12的测序探针，其中所述条形码域包含至少第三附接区域，所述第三附接区域包含能够被第三互补核酸分子结合的核酸序列且其中所述第三附接区域的所述核酸序列确定由所述靶结合域的第三个核苷酸结合的所述靶核酸中的第三个核苷酸的位置和身份且其中所述第三互补核酸分子不同于所述第一和第二互补核酸分子。44.权利要求43的测序探针，其中所述第三附接区域与至少一个侧接单链多核苷酸相邻。45.权利要求43的测序探针，其中所述条形码域包含至少第四附接区域，所述第四附接区域包含能够被第四互补核酸分子结合的核酸序列且其中所述第四附接区域的所述核酸序列确定由所述靶结合域的第四个核苷酸结合的所述靶核酸中的第四个核苷酸的位置和身份且其中所述第四互补核酸分子不同于所述第一、第二和第三互补核酸分子。46.权利要求45的测序探针，其中所述第四附接区域与至少一个侧接单链多核苷酸相邻。47.权利要求45的测序探针，其中所述条形码域包含至少第五附接区域，所述第五附接区域包含能够被第五互补核酸分子结合的核酸序列且其中所述第五附接区域的所述核酸序列确定由所述靶结合域的第五个核苷酸结合的所述靶核酸中的第五个核苷酸的位置和身份且其中所述第五互补核酸分子不同于所述第一、第二、第三和第四互补核酸分子。48.权利要求47的测序探针，其中所述第五附接区域与至少一个侧接单链多核苷酸相邻。49.权利要求47的测序探针，其中所述条形码域包含至少第六附接区域，所述第六附接区域包含能够被第六互补核酸分子结合的核酸序列且其中所述第六附接区域的所述核酸序列确定由所述靶结合域的第六个核苷酸结合的所述靶核酸中的第六个核苷酸的位置和身份且其中所述第六互补核酸分子不同于所述第一、第二、第三、第四和第五互补核酸分子。50.权利要求49的测序探针，其中所述第六附接区域与至少一个侧接单链多核苷酸相邻。51.权利要求1至50中任一项的测序探针，其中附接区域包含核酸序列的一个至五十个拷贝。52.权利要求51的测序探针，其中所述附接区域包含所述核酸序列的两个至三十个拷贝。53.权利要求1至52中任一项的测序探针，其包含可操作地连接至合成主链的多个拷贝的靶结合域。54.权利要求1至53中任一项的测序探针，其中每个互补核酸分子包含可检测标记物。55.权利要求1至54中任一项的测序探针，其中每个互补核酸分子与一级核酸分子直接连接。56.权利要求1至54中任一项的测序探针，其中每个互补核酸分子经由核酸间隔物与一级核酸分子间接连接。57.权利要求55或权利要求56的测序探针，其中每个互补核酸分子包含约8个核苷酸至约20个核苷酸。58.权利要求57的测序探针，其中每个互补核酸分子包含约10个核苷酸。59.权利要求58的测序探针，其中每个互补核酸分子包含约12个核苷酸。60.权利要求59的测序探针，其中每个互补核酸分子包含约14个核苷酸。61.权利要求55至60中任一项的测序探针，其中每个一级核酸分子与至少一个二级核酸分子杂交。62.权利要求61的测序探针，其中每个一级核酸分子与至少两个二级核酸分子杂交。63.权利要求62的测序探针，其中每个一级核酸分子与至少三个二级核酸分子杂交。64.权利要求63的测序探针，其中每个一级核酸分子与至少四个二级核酸分子杂交。65.权利要求64的测序探针，其中每个一级核酸分子与至少五个二级核酸分子杂交。66.权利要求61至65中任一项的测序探针，其中一个或多个二级核酸分子包含至少一个可检测标记物。67.权利要求61至65中任一项的测序探针，其中每个二级核酸分子与至少一个包含至少一个可检测标记物的三级核酸分子杂交。68.权利要求67的测序探针，其中每个二级核酸分子与至少两个包含至少一个可检测标记物的三级核酸分子杂交。69.权利要求68的测序探针，其中每个二级核酸分子与至少三个包含至少一个可检测标记物的三级核酸分子杂交。70.权利要求69的测序探针，其中每个二级核酸分子与至少四个包含至少一个可检测标记物的三级核酸分子杂交。71.权利要求70的测序探针，其中每个二级核酸分子与至少五个包含至少一个可检测标记物的三级核酸分子杂交。72.权利要求71的测序探针，其中每个二级核酸分子与至少六个包含至少一个可检测标记物的三级核酸分子杂交。73.权利要求71的测序探针，其中每个二级核酸分子与至少七个包含至少一个可检测标记物的三级核酸分子杂交。74.权利要求61至71中任一项的测序探针，其中至少一个二级核酸分子包含不与一级核酸分子杂交且不与三级核酸分子杂交的区域。75.权利要求74的测序探针，其中每个二级核酸分子包含不与一级核酸分子杂交且不与三级核酸分子杂交的区域。76.权利要求74或权利要求75的测序探针，其中不与一级核酸分子杂交且不与三级核酸分子杂交的区域包含与一级核酸分子连接的互补核酸分子的核苷酸序列。77.权利要求74至76中任一项的测序探针，其中不与一级核酸分子杂交且不与三级核酸分子杂交的区域位于所述二级核酸分子的末端。78.权利要求74至77中任一项的测序探针，其中不与一级核酸分子杂交且不与三级核酸分子杂交的区域包含约8个核苷酸至约20个核苷酸。79.权利要求78的测序探针，其中不与一级核酸分子杂交且不与三级核酸分子杂交的区域包含约10个核苷酸。80.权利要求79的测序探针，其中不与一级核酸分子杂交且不与三级核酸分子杂交的区域包含约12个核苷酸。81.权利要求80的测序探针，其中不与一级核酸分子杂交且不与三级核酸分子杂交的区域包含约14个核苷酸。82.核酸测序方法，其包括以下步骤：(1)使至少一个测序探针与固定至基质的靶核酸杂交；其中所述测序探针包含：靶结合域和条形码域；其中所述靶结合域包含至少四个核苷酸，并且能够结合固定的靶核酸；其中所述条形码域包含合成主链，所述条形码域包含至少第一附接区域，所述第一附接区域包含能够被第一互补核酸分子结合的核酸序列且其中所述第一附接区域的所述核酸序列确定由所述靶结合域的第一个核苷酸结合的所述固定的靶核酸中的第一个核苷酸的位置和身份和(2)使包含可检测标记物的第一互补核酸分子或包含可检测标记物的第一报告复合物的第一互补核酸分子与第一附接区域结合；(3)检测结合的第一互补核酸分子的可检测标记物或第一报告复合物的结合的第一互补核酸分子的可检测标记物；和(4)鉴定固定的靶核酸中的第一核苷酸的位置和身份。83.权利要求82的方法，其还包括以下步骤：(5)使所述第一附接区域与缺乏可检测标记物的第一杂交核酸分子接触，从而未结合所述第一互补核酸分子且使缺乏可检测标记物的所述第一杂交核酸分子与所述第一附接区域结合；(6)使包含可检测标记物的第二互补核酸分子或包含可检测标记物的第二报告复合物的第二互补核酸分子与所述第二附接区域结合，所述第二附接区域包含确定由所述靶结合域的第二个核苷酸结合的固定的靶核酸中的第二个核苷酸的位置和身份的核酸序列；(7)检测结合的第二互补核酸分子的可检测标记物或第二报告复合物的结合的第二互补核酸分子的可检测标记物；和(8)鉴定固定的靶核酸中的第二核苷酸的位置和身份。84.权利要求82或权利要求83的方法，其中步骤(5)和(6)依次或同时发生。85.权利要求82至84中任一项的方法，其中重复步骤(5)至(8)，直到所述条形码域中的每个附接区域已被包含可检测标记物的互补核酸分子或包含可检测标记物的报告复合物的互补核酸分子依次结合，且已检测依次结合的互补核酸分子的可检测标记物或报告复合物的依次结合的互补核酸分子的可检测标记物，从而对于所述测序探针的靶结合域杂交的固定的靶核酸的区域，鉴定核苷酸的线性顺序。86.权利要求82至85中任一项的方法，其中所述靶核酸首先通过至少使所述靶核酸的第一位置与包含选择性结合至基质的第一亲和标签的第一捕获探针结合而固定至基质。87.权利要求86的方法，其中所述靶核酸通过应用足以延伸在第一位置固定至基质的靶核酸的力而伸长。88.权利要求87的方法，其中所述力是重力、流体动力、电磁力、流动-拉伸、后退弯月面技术或其组合。89.权利要求86至88中任一项的方法，其中所述靶核酸进一步通过使所述靶核酸的至少第二位置与包含选择性结合至基质的亲和标签的至少第二捕获探针结合而固定至基质。90.权利要求89的方法，其中所述靶核酸在约3个至约10个位置固定至基质。91.权利要求89的方法，其中一旦所述靶核酸的第二位置固定至所述基质，就可以去除所述力。92.权利要求82的方法，其中所述靶核酸在一个或多个位置固定至基质。93.权利要求82至92中任一项的方法，其中延长所述固定的靶核酸。94.权利要求82至93中任一项的方法，其中所述合成主链包含多糖、多核苷酸、肽、肽核酸或多肽。95.权利要求82至94中任一项的方法，其中所述合成主链包含单链DNA或单链RNA或单链PNA。96.权利要求82至95中任一项的方法，其中所述测序探针在所述靶结合域和所述条形码域之间包含双链DNA间隔物。97.权利要求82至96中任一项的方法，其中所述第一附接区域与至少一个侧接单链多核苷酸相邻。98.权利要求82至97中任一项的方法，其中所述第一互补核酸是RNA、DNA或PNA或其它多核苷酸类似物。99.权利要求82至98中任一项的方法，其中所述靶结合域中的第一核苷酸是修饰的核苷酸或核酸类似物。100.权利要求82的方法，其中所述条形码域包含至少第二附接区域，所述第二附接区域包含能够被第二互补核酸分子结合的核酸序列且其中所述第二附接区域的所述核酸序列确定由所述靶结合域的第二个核苷酸结合的所述固定的靶核酸中的第二个核苷酸的位置和身份且其中所述第一互补核酸分子不同于所述第二互补核酸分子。101.权利要求100的方法，其中所述第二附接区域与至少一个侧接单链多核苷酸或多核苷酸类似物相邻。102.权利要求100的方法，其中所述第二互补核酸是RNA、DNA或PNA。103.权利要求100的方法，其中所述靶结合域中的第二核苷酸是修饰的核苷酸或核酸类似物。104.权利要求83至103中任一项的方法，其中所述第一互补核酸分子和缺乏可检测标记物的第一杂交核酸分子包含相同的核酸序列。105.权利要求82至104中任一项的方法，其中缺乏可检测标记物的第一杂交核酸分子包含与相邻于所述第一附接区域的侧接单链多核苷酸互补的核酸序列。106.权利要求105的方法，其中所述靶结合域包含至少三个核苷酸，且其中所述条形码域包含至少第三附接区域，所述第三附接区域包含能够被第三互补核酸分子结合的核酸序列，且其中所述第三附接区域的所述核酸序列确定由所述靶结合域的第三个核苷酸结合的所述靶核酸中...

【专利技术属性】
技术研发人员：JM贝彻姆，R哈菲佐夫，
申请(专利权)人：纳米线科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US