用于核酸扩增的组合物和方法技术

本发明专利技术涉及用于包括引物延伸、核酸扩增、单核苷酸多态性检测和RT‑PCR在内的各种生物测定的寡核苷酸。所述寡核苷酸包含互补于靶序列的5’区以及处于或靠近该寡核苷酸的3’端的阻断基团。引物延伸仅在酶去除该阻断基团之后发生。

Compositions and methods for nucleic acid amplification

The present invention relates to a variety of creatures including oligonucleotide primer extension, nucleic acid amplification and detection of single nucleotide polymorphisms and RT PCR, determination. The oligonucleotide comprises a 5 'region complementary to a target sequence and a blocking group located at or near the 3' end of the oligonucleotide. Primer extension occurs only after the enzyme has removed the blocking group.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于核酸扩增的组合物和方法交叉引用本申请要求2014年11月20日提交的第62/082,534号美国临时专利申请、2014年11月20日提交的第62/082,538号美国临时专利申请和2014年11月20日提交的第62/082,541号美国临时专利申请的优先权，这些申请均通过引用以其全文并入本文以用于所有目的。
技术介绍
核酸扩增方法允许扩增样品如生物样品中的核酸分子。核酸分子可以经由例如基于热循环的方法(例如，聚合酶链反应(PCR))或经由等温方法来扩增。核酸扩增还可以用于制备核酸分子以供与核酸分析相关的许多应用中的后续分析，这些应用例如是检测靶核酸序列、检测样品中的罕见核酸分子/序列和/或制备用于测序反应的核酸分子。然而，核酸扩增反应可以生成可降低核酸扩增反应的效率和/或特异性的非特异性扩增产物，如引物二聚体副产物。因此，由于核酸扩增对于广泛应用的适用性，对于可用于扩增帮助使核酸扩增过程中非特异性扩增产物生成最小化的核酸分子的组合物和方法存在需要。
技术实现思路
本公开内容提供了用于核酸扩增和分析的组合物和方法。本公开内容的一方面提供了具有约6至60个核苷酸长度的引物。该引物从5’端到3’本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有约6至60个核苷酸长度的引物，所述引物从5’端到3’端包含(a)基本上互补于靶核酸分子的核苷酸序列A，和(b)相对于所述靶核酸分子的一个或多个相应核苷酸非互补的在所述3’端的分子部分，并且其中所述3’端适合于仅在去除所述分子部分时在引物延伸反应中延伸以形成所述靶核酸分子的互补核酸链。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.20 US 62/082,541;2014.11.20 US 62/082,534;1.一种具有约6至60个核苷酸长度的引物，所述引物从5’端到3’端包含(a)基本上互补于靶核酸分子的核苷酸序列A，和(b)相对于所述靶核酸分子的一个或多个相应核苷酸非互补的在所述3’端的分子部分，并且其中所述3’端适合于仅在去除所述分子部分时在引物延伸反应中延伸以形成所述靶核酸分子的互补核酸链。2.根据权利要求1所述的引物，其中所述引物是发夹环形引物，其特征在于所述核苷酸序列A显示出与(1)自身和/或(2)所述分子部分的序列互补性。3.根据权利要求1所述的引物，其中所述引物是分离且纯化的核酸链。4.根据权利要求1所述的引物，其中所述3’端可被具有3’到5’外切核酸酶活性的酶切割。5.根据权利要求1所述的引物，其中所述引物适用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。6.根据权利要求1所述的引物，其中所述分子部分包含具有相对于所述靶核酸分子的1-10个相应核苷酸非互补的1-10个连续核苷酸的核苷酸序列B。7.根据权利要求1所述的引物，其中所述核苷酸序列A具有一定的长度，该长度提供相对于所述靶核酸分子的充分互补性。8.根据权利要求1所述的引物，其中所述分子部分为至少一个核苷酸、核苷酸类似物或非核苷酸物质。9.根据权利要求1所述的引物，其中所述分子部分包含磷酸二酯键或为n-磷酸酯部分，其中‘n’大于或等于1。10.根据权利要求1所述的引物，其中所述分子部分适合于防止包含所述引物的引物二聚体分子复合体的形成。11.根据权利要求1所述的引物，其中所述引物具有6至20个核苷酸的长度。12.根据权利要求1所述的引物，其中所述分子部分具有1至10个单独物质的长度。13.根据权利要求1所述的引物，其中所述分子部分包含具有非天然碱基或无碱基的核苷酸类似物。14.根据权利要求1所述的引物，其中所述引物适用于单核苷酸多态性检测。15.一种引物组，其包含如权利要求1所述的引物和与所述靶核酸分子的互补核酸链显示出序列互补性的至少一种附加引物。16.根据权利要求15所述的引物组，其中当在具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶的存在下在扩增反应中使用时，所述引物组产生基本上不含引物二聚体副产物的扩增靶核酸。17.根据权利要求16所述的引物组，其中引物二聚体副产物以一定的浓度存在，如通过所述扩增靶核酸的解链曲线所测，该浓度小于所述扩增靶核酸的约10％。18.一种包含如权利要求1所述的引物的溶液。19.一种包含正向引物和反向引物的引物组，其中所述正向和反向引物中的每一种从5’端到3’端包含(a)基本上互补于靶核酸分子或其互补体的核苷酸序列A，和(b)相对于所述靶核酸分子或所述互补体的一个或多个相应核苷酸非互补的在3’端的分子部分，其中所述正向引物的分子部分和所述反向引物的分子部分彼此不互补，并且其中所述正向引物和反向引物仅在去除所述分子部分时以模板指导的方式可延伸。20.根据权利要求19所述的引物组，其中所述正向引物和/或反向引物是发夹环形引物，其特征在于所述序列A显示出与(1)自身和/或(2)所述分子部分的序列互补性。21.根据权利要求19所述的引物组，其中所述正向和反向引物是分离且纯化的核酸链。22.根据权利要求19所述的引物组，其中所述3’端可被具有3’到5’外切核酸酶活性的酶切割。23.根据权利要求19所述的引物组，其中所述正向引物和/或反向引物适用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。24.根据权利要求19所述的引物组，其中所述分子部分包含具有相对于所述靶核酸分子或所述互补体的1-10个相应核苷酸非互补的1-10个连续核苷酸的核苷酸序列B。25.根据权利要求19所述的引物组，其中所述核苷酸序列A具有一定的长度，该长度提供相对于所述靶核酸分子或所述互补体的充分互补性。26.根据权利要求19所述的引物组，其中所述分子部分为至少一个核苷酸、核苷酸类似物或非核苷酸物质。27.根据权利要求19所述的引物组，其中所述分子部分包含磷酸二酯键或为n-磷酸酯部分，其中‘n’大于或等于1。28.根据权利要求19所述的引物组，其中所述分子部分适合于防止包含所述正向引物和/或所述反向引物的引物二聚体分子复合体的形成。29.根据权利要求19所述的引物组，其中所述正向引物和/或反向引物具有6至20个核苷酸的长度。30.根据权利要求19所述的引物组，其中所述分子部分具有1至10个单独物质的长度。31.根据权利要求19所述的引物组，其中所述分子部分包含具有非天然碱基或无碱基的核苷酸类似物。32.根据权利要求19所述的引物组，其中所述正向引物和/或反向引物适用于单核苷酸多态性检测。33.一种包含如权利要求19所述的引物组的溶液。34.一种用于核酸扩增的方法，其包括：a)使(1)正向引物与单链靶核酸分子退火以及使(2)反向引物与所述单链靶核酸分子的互补体退火，其中所述正向和反向引物中的每一种从5’端到3’端包含相对于所述单链靶核酸分子或所述互补体的一个或多个相应核苷酸非互补的在3’端的分子部分，并且其中所述正向引物的分子部分和所述反向引物的分子部分彼此不互补；b)以模板指导的方式延伸所述正向引物和所述反向引物以产生双链靶核酸分子；c)使所述双链靶核酸分子变性，以生成单链靶核酸分子；以及d)重复(a)-(c)至少一个循环以产生扩增的双链靶核酸分子。35.根据权利要求34所述的方法，其中在所述至少一个循环之后，包含所述正向引物和/或所述反向引物的引物二聚体副产物以一定的浓度存在，如通过所述扩增的双链靶核酸分子的解链曲线分析所测，该浓度小于所述扩增的双链靶核酸分子的约10％。36.根据权利要求34所述的方法，其中(a)-(d)在分区中进行。37.根据权利要求36所述的方法，其中所述分区为孔。38.根据权利要求36所述的方法，其中所述分区为小滴。39.根据权利要求34所述的方法，其进一步包括检测所述扩增的双链靶核酸分子的至少一个亚组。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述检测为光学检测、静电检测或电化学检测。41.根据权利要求34所述的方法，其进一步包括在(b)之前去除所述正向引物的所述分子部分和所述反向引物的所述分子部分。42.一种用于核酸扩增的方法，其包括：使含有具有单链靶核酸分子的核酸样品的反应混合物在产生所述核酸样品的扩增产物的条件下经历核酸扩增反应，其中所述反应混合物包含：(a)正向引物，其互补于所述单链靶核酸分子且包含相对于所述单链靶核酸分子的一个或多个相应核苷酸非互补的在3’端的第一分子部分；和(b)反向引物，其互补于所述单链靶核酸分子的互补体且包含相对于所述互补体的一个或多个相应核苷酸非互补的在3’端的第二分子部分，其中所述第一分子部分和所述第二分子部分彼...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴开原，苏明迪，苏星，
申请(专利权)人：安普里怀斯公司，
类型：发明
国别省市：美国,US