检测22个位点耳聋基因多态性的SNaPshot试剂的应用制造技术

本发明专利技术提供了引物组在制备检测多种耳聋基因多态性的SNaPshot试剂中的应用，检测的耳聋基因多态性位点包括GJB2基因位点rs80338939、rs80338942、rs80338943、rs111033204、176_191del16、c.35dupG、508_511dupAACG；GJB3基因rs74315318、rs74315319；SLC26A4基因rs111033220、rs201562855、rs111033305、rs192366176、rs111033318、rs121908362、rs121908363、rs200455203、rs111033380、rs111033313、c.281C>T；线粒体DNArs267606619、rs267606617。

Application of SNaPshot reagent for detecting deafness gene polymorphism of 22 loci

The present invention provides a primer set by SNaPshot reagent was used to detect a variety of deafness gene polymorphism in the system, deafness gene polymorphism detection including GJB2 gene loci rs80338939, rs80338942, rs80338943, rs111033204, 176_191del16, c.35dupG, 508_511dupAACG, rs74315318, rs74315319; GJB3 gene; SLC26A4 gene rs111033220, rs201562855, rs111033305, rs192366176, rs111033318 rs121908363, rs200455203, rs121908362, rs111033380, c.281C>, rs111033313, DNArs267606619, rs267606617; T; mitochondria.

【技术实现步骤摘要】
检测22个位点耳聋基因多态性的SNaPshot试剂的应用
本专利技术涉及分子生物学诊断领域和遗传病领域。具体地，本专利技术提供了一种检测多种耳聋基因多态性的SNaPshot试剂盒。
技术介绍
先天性耳聋是最常见的出生缺陷之一，也是最常见的人类感觉系统疾病，发病率为0.1％-0.3％。60％的耳聋与遗传因素相关。在这些遗传因素中，主要包括GJB2、SLC26A4、GJB3基因和线粒体DNAm.1555A>G和m.1494C>T位点。在中国新生儿耳聋基因突变筛查中，GJB2基因突变具有较高的携带率，约2.6％，SLC26A4基因突变携带率约为1.9％，新生儿线粒体DNAm.1555A>G均质突变占0.1％，GJB3基因突变仅在少数患者中发现。GJB2基因编码的Cx26表达于耳蜗，位于内耳血管纹、基底膜和螺旋缘，与先天性遗传性中重度耳聋相关，GJB2基因突变后，K+进入内淋巴液的循环受到影响，导致常显或常隐感音神经性耳聋(DFNB1或DFNA3)。GJB3基因编码的Cx31是缝隙连接蛋白的一员，在耳蜗和听神经内表达，突变可导致常显或常隐非综合性耳聋、周围神经疾病伴听力丧失。SLC26A4基因主要引起中国人大前庭水管综合征，可结合颞骨CT进行检测。此病出生时听力可能正常，或有轻度至中重度的听力损失，因堕床、儿童玩耍或体育活动中的轻度碰撞或感冒可以造成明显的听力下降，其临床表现与发病年龄、耳聋程度以及是否伴有眩晕有密切的关系。线粒体DNA突变为母系遗传，线粒体DNAm.1494C＞T、m.1555A＞G与氨基糖甙类药物致聋和非综合征型耳聋有关。中国不同地区的非综合征型耳聋患者中，各基因的突变比例有所差异，主要突变基因为GJB2基因，SLC26A4基因和线粒体DNAm.1555A>G和m.1494C>T位点，GJB3基因突变仅在少数患者中发现，GJB2基因主要突变方式为c.235delC，约占GJB2基因突变的63.6-76.8％，其次是c.299_300delAT和c.176_191del16约占8.7％-13.1％，c.508_511dupAACG约占4.3％-6.3％。SLC26A4基因的主要突变为c.2168A>G和c.919-2A>G，约占SLC26A4基因突变的77.1％-84.67％，c.1975G>C和c.2162C>T等分别约占1％-2.5％。线粒体DNA耳聋基因主要突变为m.1555A>G，m.1494C>T。由于其他测序检测方法多存在准确度，特异性，精密度不足的问题，目前的耳聋基因多态性检测一般仍然采用sanger法进行，其一次实验中仅能检测一个位点，而且花费时间较长。这种困难造成的耳聋基因多态性检测，特别是能覆盖广泛耳聋基因多态性位点的筛查难以普及，即使在北京，上海等城市，新生儿免费耳聋基因筛选也仅覆盖两个GJB2和SLC26A4位点，需要自费数百元的进一步筛查也仅多4个位点，这样的筛查无疑会遗漏大量潜在的遗传性耳聋患者，对其今后的保健和治疗带来不利影响。此外，上述检测手段的局限也使得遗传病相关科研工作难以大规模开展。Snapshot通过为不同位点设计不同长度的引物进行Snapshot反应，产物经电泳分离，荧光检测，Genemapper分析，可一次性检测多个SNP位点，而且每次反应中仅需极少量DNA样本。比一般PCR方法复杂的是，Snapshot检测体系，特别是多重Snapshot检测体系设计中需要考虑的因素众多：引物长度，Tm值，尾部结构选择，以及模板和引物的比例都可能造成非特异性扩增和随后的碱基误读。设计可靠的多重Snapshot检测体系需要对引物设计进行缜密考虑，大量验证并进行相应调整。目前将该检测技术应用于耳聋SNP位点检测的实例仅有CN103911452A和CN102618624A，前者的检测对象包括GJB2基因35、109、176-199、235、299-300位点，SLC26A4基因1174、1226、1229、1975、2027、2162、2168、IVS7-2位点、线粒体DNA1494、1555、3243、7444位点的突变。后者的检测对象包括GJB2基因235、299-300位点，SLC26A4基因2168、IVS7-2位点，线粒体DNA1555、3243、7445位点。两者均已经获得授权。但仍有部分耳聋相关SNP位点，如c.508_511dupAACG,SLC26A4-919-2，GJB3的GJB3-547、538位点等没有被覆盖，其中的c.508_511dupAACG,SLC26A4-919-2还是我国人群中出现率较高的突变位点。设计能囊括更广泛耳聋相关位点，特别是现有的试剂盒未涉及的位点的Snapshot试剂盒，对于遗传性耳聋的预防和科研具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术利用Snapshot技术一次性检测多个耳聋基因多态性位点，速度快并且节约时间和费用。可以检测到80％以上中国遗传性非综合征型耳聋人群，有助于及早发现携带耳聋基因突变的患儿(包括迟发性听力缺陷患儿)，为后期的诊断及治疗提供科学依据，有助于及时采取干预措施预防言语障碍的发生，有效地降低聋哑发病率。一方面，本专利技术提供了引物组在制备检测多种耳聋基因多态性的SNaPshot试剂中的应用，引物具体序列为：管1的扩增引物：管2的扩增引物：管1的测序引物：管2的测序引物：进一步地，其中测序引物浓度比例如下：管1各测序引物的浓度:引物名称终浓度(pmol)测序引物SNE1-DFN-35delG0.6测序引物SNE1-DFN-167delT1.2测序引物SNE1-DFN-del161.2测序引物SNE1-DFN-35dupG0.8测序引物SNE2-GJB3-5380.25测序引物SNE2-GJB3-5472测序引物SNE2-12srRNA-15550.6测序引物SNE2-12srRNA-14940.8测序引物SNE3-SLC26A4-2810.025测序引物SNE2-SLC26A4-12290.6测序引物SNE2-SLC26A4-12260.03测序引物SNE2-SLC26A4-11740.2管2各测序引物的浓度:进一步地，其中测序引物浓度比例如下：其中扩增引物在进行扩增时，扩增试剂比例如下：其中，扩增引物的比例均为1：1。进一步地，扩增产物在进行微测序时，测序试剂比例如下：另一方面，本专利技术提供了一种利用Snapshot技术一次性检测多个耳聋基因多态性位点的非诊断科研方法，具体包括步骤：DNA提取：以人血的采集样本进行DNA提供，具体参考公司有关《血液基因组DNA提取标准操作流程》，提取完毕的DNA计算其浓度并稀释至5-10μg/mL；试剂准备：a)配置二倍的MasterMix，这其中包括dNTP、MgCl2、热启动超保真DNA聚合酶、缓冲液，室温融化后，短暂离心；准备好合适数量的PCR反应管；b)配制前述扩增引物混合物：各引物的比例均为＝1:1，震荡混匀；短暂离心后备用；c)反应体系配制d)震荡混匀，短暂离心后，分装23μL至标记好的PCR反应管。转移至标本制备区；加样a)若样品及质控品保存在-20℃，使用前置室温解冻，并短暂离心；b)向分装好的本文档来自技高网...

【技术保护点】
引物组在制备检测多种耳聋基因多态性的SNaPshot试剂中的应用，引物具体序列为：管1的扩增引物：

【技术特征摘要】
1.引物组在制备检测多种耳聋基因多态性的SNaPshot试剂中的应用，引物具体序列为：管1的扩增引物：管2的扩增引物：管1的测序引物：管2的测序引物：2.权利要求1所述的应用，其中测序引物浓度比例如下：管1各测序引物的浓度:管2各测序引物的浓度:3.权利要求1或2任一项所述的试剂盒,其中扩增引物在进行扩增时，扩增试剂比例如下：其中，扩增引物的比例均为1：1。4.权利要求1或2任一项所述的试剂盒，扩增产物在进行微测序时，测序试剂比例如下：5.一种利用Snapshot技术一次性检测多个耳聋基因多态性位点的非诊断科研方法，具体包括步骤：DNA提取：以人血的采集样本进行DNA提供，具体参考公司有关《血液基因组DNA提取标准操作流程》，提取完毕的DNA计算其浓度并稀释至5-10μg/mL；试剂准备：a)配置二倍的MasterMix，这其中包括dNTP、MgCl2、热启动超保真DNA聚合酶、缓冲液，室温融化后，短暂离心；准备好合适数量的PCR反应管；b)配制权利要求1所列的扩增引物混合物：各引物的比例均为＝1:1，震荡混匀；短暂离心后备用；c)反应体系配制d)震荡混匀，短暂离心后，分装23μL至标记好的PCR反应管。转移至标本制备区；加样a)若样品及质控品保存在-20℃，使用前置室温解冻，并短暂离心；b)向分装好的PCR反应管中加入10ngDNA模板，并进行稀释；c)盖好管盖后，震荡混匀，短暂离心，转移至PCR扩增区；PCR扩增：置PCR管放于PCR仪上。反应程序设置如...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵薇薇，胡昌明，徐艳艳，陈白雪，贺书香，刘晶星，于世辉，
申请(专利权)人：广州金域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44