microRNA检测探针及石墨烯检测方法技术

本发明专利技术公开一种microRNA石墨烯检测方法，（1）、H1/H2‑GO复合物的构建：将荧光标记的发夹探针H1与H2分别在95℃下孵化5min；将探针缓慢冷却至室温并孵化1h以上；最后，将GO与发夹探针一同加入到1×SPSC缓冲溶液当中，室温下孵化0.5h，形成稳定的H1/H2‑GO复合物；（2）、在含有H1/H2‑GO复合物的1×SPSC缓冲溶液体系中，首先加入靶目标miRNAs，然后加入RecQE以及ATP，避光条件下37℃，孵化50min；最后，测量系统HCR产物的荧光信号强度。本发明专利技术方法比无酶HCR/GO传感平台的检测灵敏度高出两个数量级，是目前化学发光检测方法中灵敏度最高的检测手段，具有重要的潜在应用价值。

MicroRNA detection probe and method for detecting graphene

The invention discloses a method for detecting microRNA graphene, (1), H1/H2 GO building complexes: H1 hairpin probe and H2 fluorescent markers were hatching 5min at 95 DEG C; the probe slowly cooled to room temperature and hatch above 1H; finally, the GO and the hairpin probe joined to 1 * SPSC buffer solution, incubation at room temperature 0.5h, H1/H2 GO formed stable complexes; (2), with H1/H2 GO complex 1 * SPSC buffer solution, first join the target miRNAs, then add RecQE and ATP, under dark conditions of 37 DEG C, incubation of 50min; finally, the fluorescence signal strength measurement system of HCR products. The method of the invention is two orders of magnitude higher than the detection sensitivity of the enzyme free HCR/GO sensing platform, and is the most sensitive detection method in the chemiluminescence detection method at present, and has important potential application value.

【技术实现步骤摘要】
microRNA检测探针及石墨烯检测方法
本专利技术属于肿瘤检测
，具体为一种microRNA检测探针及石墨烯检测方法。
技术介绍
癌症是全球一个主要死亡原因，中国首当其冲，中国新诊断癌症病例为307万，占全球总数的21.8%。癌症死亡人数约220万，占到全球癌症死亡人数的26.9%。MicroRNA是基因表达的重要调节器。肿瘤发生时，microRNA调节致癌与肿瘤抑制途径。MicroRNA不仅和癌症的发生有关，而且能够为相关癌症的治疗提供新的工具和希望。let-7家族是目前研究最为广泛的一类miRNA，也是肿瘤抑制因子。let-7通过靶向多种原癌基因、细胞周期及细胞增殖过程中的关键因子来发挥调控作用，在肿瘤的诊断和预后判断中起重要作用，与肺癌关系尤为密切。在正常组织中，let-7随着细胞的分化而表达水平升高，其靶向的原癌基因如HMGA2和RAS等则表达下调。肺癌中let-7表达时常降低，且let-7所在染色体区域也常缺失，而其靶基因表达却升高。因此可以通过检测细胞内let-7的含量来预测细胞的癌变程度。石墨烯是一种新型的纳米材料，其内部结构非常独特，它具有六角晶格的结构，每两个碳原子构成一个元胞，每个碳原子与邻近的原子可以构成3个σ键和一个π键。石墨烯表面具有超强的吸附能力，利用此性能，石墨烯可以吸附染料分子（或者荧光基团标记的生物分子），发生高效的能量转移，导致染料分子的荧光信号碎灭。由于石墨烯这一独特性能，可以将其应用于生物分子的检测领域。
技术实现思路
let-7家族是目前研究最为广泛的一类miRNA，在正常的细胞中，let-7家族正常表达；而大多数肿瘤细胞中，let-7表达下调，因此可以通过检测细胞内let-7的含量来预测细胞的癌变程度。本专利技术利用氧化石墨烯对DNA单双链的吸附性能不一样，设计let-7的荧光探针，并创造性的引入解旋酶和ATP，使得本专利技术的检测方法比同类型的检测方法，在灵敏度上提高20%，可以快速、准确的检测出let-7的含量，对肿瘤的早期检测有一定的实际意义。本专利技术目的是提供一种高效、灵敏的microRNA检测方法，该方法应用了杂交链式反应（HCR）信号放大和氧化石墨烯（GO）表面固定的检测手段。本专利技术是采用如下技术方案实现的：本专利技术的技术方案之一为，microRNA检测探针，Cy3荧光标记的茎环结构的DNA探针设计为H1：AGTAGCAAGTATAGTTCAAAGTAACTATACAACCTACTACCTCA-Cy3；H2：Cy3-ACTTTGAACTATACTTGCTACTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT。本专利技术的技术方案之二为，microRNA石墨烯检测方法，将解旋酶和ATP引入杂交链式反应的miRNA检测体系中，构建增强型HCR反应体系，其中Cy3荧光标记的茎环结构的DNA探针设计为H1：AGTAGCAAGTATAGTTCAAAGTAACTATACAACCTACTACCTCA-Cy3；H2：Cy3-ACTTTGAACTATACTTGCTACTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT；具体步骤如下：（1）、H1/H2-GO复合物的构建首先，将荧光标记的发夹探针H1与H2分别在95℃下孵化5min；然后，将探针缓慢冷却至室温并孵化1h以上；最后，将GO与发夹探针一同加入到1×SPSC缓冲溶液当中，室温下孵化0.5h，形成稳定的H1/H2-GO复合物；在该体系中，两种稳定的茎环结构的DNA探针在没有靶标miRNA的溶液中能够稳定的共存，但是当加入靶标miRNA作为引发剂之后，靶标miRNA即会引发一连串的杂交反应，产物是带有缺口的长链双螺旋DNA结构。（2）、在含有H1/H2-GO复合物的1×SPSC缓冲溶液体系中，首先加入靶目标miRNAs，然后加入RecQE以及ATP，避光条件下37℃，孵化50min；最后，测量系统HCR产物的荧光信号强度。为了提高对miRNA的检测灵敏度，本专利技术在石墨烯载体上固定了杂交链式反应（HCR）信号放大技术，同时创造性的引入了RecQE解旋酶辅助HCR以增强检测信号（如图1所示），RecQE解旋酶利用ATP水解能量可以将探针的二级发夹结构解旋成单链。miRNA通过与解旋的发夹探针可以快速有效地启动HCR，实现荧光信号快速放大。GO作为纳米载体可以将HCR产物富集于GO表面，使荧光信号集中起来。反应结束后，解旋酶对HCR产品的解旋率与自由的探针结合HCR产品的速率达到平衡，从而在GO表面产生强而稳定的荧光信号。本专利技术创造性的使用解旋酶来增强检测信号，解旋酶辅助HCR/GO检测平台的灵敏度比无酶HCR/GO检测平台高出2个数量级。同时，反应时间从4小时缩短至50分钟。因此，此检测平台在高效精密检测低丰度miRNA和生物标志物应用中具有极大的潜力。同时，此研究结果也为进一步研究活细胞内miRNA成像奠定了试验和理论基础。附图说明图1表示基于RecQE酶促的杂交链反应传感平台的检测miRNA原理流程图。图2A表示不同浓度的RecQE在存在或不存在ATP（50μM）情况下对HCR/GO检测系统荧光信号强度的作用，RecQE浓度：0，2，4，6，8，10，12nM。图2B表示不同浓度的ATP在存在或不存在RecQE（10nM）情况下对HCR/GO检测系统荧光信号强度的作用，ATP浓度：0，10，20，30，40，50，60μM。图3表示不同浓度的靶目标let-7a的荧光光谱。图4表示不同miRNA所对应的系统荧光信号强度。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的具体实施例进行详细说明。1、H1/H2-GO复合物的构建Cy3荧光标记的茎环结构的DNA探针设计为H1：AGTAGCAAGTATAGTTCAAAGTAACTATACAACCTACTACCTCA-Cy3；H2：Cy3-ACTTTGAACTATACTTGCTACTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT；构建H1/H2-GO复合物系统中含20nMH1、20nMH2以及12μg/mLGO。首先，将荧光标记的发夹探针H1与H2分别在95℃下孵化5min。然后，将探针缓慢冷却至室温并孵化1h以上，以确保探针能够形成预期的发夹结构。最后，将GO与发夹探针一同加入到1×SPSC缓冲溶液（0.75MNaCl，50mMNa2HPO4，pH7.4）当中，室温下孵化0.5h，形成稳定的H1/H2-GO复合物。2、RecQE和ATP对H1/H2-GO复合物的影响在含有H1/H2-GO复合物的1mL1×SPSC缓冲溶液体系中，加入不同浓度的RecQE或ATP，37℃孵化50min。然后，分别测量不同RecQE或ATP浓度下的荧光信号强度。每组数据重复操作三次后测量取平均值，并计算出标准误差。3、RecQE和ATP各自对HCR/GO传感平台的影响在含有H1/H2-GO复合物的1mL1×SPSC缓冲溶液体系中，首先加入固定浓度（200pM）的靶目标let-7a，然后加入不同浓度的RecQE或ATP，37℃孵化50min。最后，分别测量系统在不同RecQE或ATP浓度下的荧光信号强度。每组数据重复操作三次后测量取平均值，并计算出标准误差。4、RecQE和ATP共同作用对HCR/GO传感平台的影响在含有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种microRNA检测探针，其特征在于：Cy3荧光标记的茎环结构的DNA探针设计为H1：AGTAGCAAGTATAGTTCAAAGTAACTATACAACCTACTACCTCA‑Cy3；H2：Cy3‑ACTTTGAACTATACTTGCTACTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT。

【技术特征摘要】
1.一种microRNA检测探针，其特征在于：Cy3荧光标记的茎环结构的DNA探针设计为H1：AGTAGCAAGTATAGTTCAAAGTAACTATACAACCTACTACCTCA-Cy3；H2：Cy3-ACTTTGAACTATACTTGCTACTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT。2.一种microRNA石墨烯检测方法，其特征在于：将解旋酶和ATP引入杂交链式反应的miRNA检测体系中，构建增强型HCR反应体系，其中Cy3荧光标记的茎环结构的DNA探针设计为H1：AGTAGCAAGTATAGTTCAAAGTAACTATACAACCTACTACCTCA-Cy3；H2：Cy3-ACTTTGAACTATACTTGCTACTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT；具体步骤如下：（1）、H1/H2-GO复合物的构建首先，将荧光标记的发夹探针H1与H2分别在95℃下孵化5min；然后，将探针缓慢冷却至室温并孵化1h以上；最后，将GO与发夹探针一同加入到1×SPSC缓冲溶液当中，室温下孵化0.5h，形成稳定的H1/H2-GO复合物；（2）、在含有H1/H2-GO复合物的1×SPSC缓冲溶液体系中，首先加入靶目标...

【专利技术属性】
技术研发人员：范晓军，齐艺，李瑶，陈良华，
申请(专利权)人：太原理工大学，
类型：发明
国别省市：山西,14