一种等温快速扩增检测食品中致病菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种等温快速扩增检测食品中致病菌的方法，属于食品安全检测技术领域。本发明专利技术通过多重序列对比确定了针对各菌的检测靶核酸，设计了特异性的分子信标探针和引物，以各菌株基因组DNA为模板，建立了实时荧光CSDPR，进行等温核酸扩增，并且验证了CSDPR方法的特异性、灵敏度和最低检测限，还通过实际样品的检测确定了本发明专利技术建立的方法具有实际可行性。本发明专利技术方法对于食品中的多种致病菌的检测具有通用性，包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌、志贺氏菌等，仅需替换掉分子信标探针中的特定部分，即可实现对不同致病菌的有效检测，而且检测灵敏度、特异性高，原理与操作简单，样品前处理简单。

Method for isothermal rapid amplification detection of pathogenic bacteria in food

The invention discloses a method for detecting and detecting pathogenic bacteria in foods by isothermal and rapid amplification, belonging to the technical field of food safety detection. The present invention for the detection of target nucleic acid bacteria was determined by multiple sequence comparison, the design of molecular beacon probes and primers specific to each strain, genomic DNA as template, a real-time fluorescent CSDPR for isothermal nucleic acid amplification, and CSDPR method is proved the specificity, sensitivity and limit of detection, by detecting the actual samples to determine the method of the invention has practical feasibility. The detection method of the invention for a variety of pathogens in food is universal, including Staphylococcus aureus, Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli, Shigella, only need to replace the specific part of the molecular beacon probe, can realize the effective detection of different pathogens, detection sensitivity, and with the principle of high specificity, simple operation, simple sample preparation.

【技术实现步骤摘要】
一种等温快速扩增检测食品中致病菌的方法
本专利技术涉及一种等温快速扩增检测食品中致病菌的方法，属于食品安全检测

技术介绍
近年来，在全球化背景下，伴随着全球食品贸易迅速增长，人口的全球流动，以及耐药型菌株的出现，食源性疾病的发生率和致死率都在逐渐提升，并成为全世界食品安全与公共卫生领域的重要问题。通过污染的食物或水进行传播并引发食源性疾病的微生物(包括细菌、病毒、真菌和寄生虫)被称为食源性致病微生物。在国外，由致病微生物引起的食源性疾病案例中，主要的致病因素是致病性细菌(或称食源性致病菌)，最常见的食源性致病菌包括肠出血性大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、空肠弯曲杆菌、蜡样芽胞杆菌以及多种弧菌等等。在我国，从2014年7月1日开始实施的强制性国家标准《GB29921-2013食品安全国家标准食品中致病菌限量》(《GB29921-2013》)中为肉制品、水产制品、粮食制品等十一大类食品设置了最常见五种致病菌的限量，包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠埃希氏菌O157：H7和副溶血性弧菌。因此，建立快速有效的检测食源性致病菌的方法变得尤为重要。针对食源性致病菌的检测技术具有局限性，还有继续提升的空间。在国际上较为通用的传统致病菌检测方法主要有传统培养法、免疫检测法和聚合酶链式反应法(PCR法)三大类。目前，已有报道的致病菌快速检测方法，主要有酶联免疫吸附技术、免疫层析技术、双功能抗体检测技术、直接落射荧光滤膜技术、近红外光谱技术、拉曼光谱技术、电阻抗技术、微量量热技术、ATP生物发光技术、DNA探针技术、基因芯片技术]、核酸等温扩增技术等。在不同的前提条件下，不同的检测技术有着各自的优点和局限性，但缺乏既符合耗时短、费用低、灵敏度高、操作简单等特点又能满足基层检测需求的检测方法。以金黄色葡萄球菌为例。金黄色葡萄球菌易污染的食品主要有乳制品、蛋及蛋制品、熟肉制品等。大多数金黄色葡萄球菌菌株都能分泌一系列酶和细胞毒素，其肠毒素会刺激呕吐中枢，引起恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状，食用每100g含18μg金黄色葡萄球菌肠毒素的食物即可引起食物中毒。目前已建立的金黄色葡萄球菌的检测方法主要包括传统微生物培养法、酶联免疫吸附分析法(ELISA)、酶联荧光分析法(ELFA)、聚合酶链式反应(PCR)等。相关的PCR方法从分子水平上检测金黄色葡萄球菌，具有较高的特异性和灵敏度，特别是实时荧光定量PCR法，可以实时检测体系的反应过程，避免了实验过程中EB等致癌物质的污染，因此在检测方法中具有一定的优势，但是反应过程需要昂贵且复杂的仪器，检测成本高，很难实现基层化，在应用范围上受到限制。此外，目前也缺乏能够同时快速定量检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌、志贺氏菌等多种食源性致病菌的方法。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种快速检测食品中致病菌的方法，所述方法实时荧光循环链置换聚合酶反应(CSDPR)技术。本专利技术通过多重序列对比确定了针对各菌的检测靶核酸，设计了特异性的分子信标探针和引物，以各菌株基因组DNA为模板，建立了实时荧光CSDPR，进行等温核酸扩增，根据扩增后的样品荧光强度验证CSDPR方法的特异性，根据扩增曲线验证实时荧光定量CSDPR方法的灵敏度和最低检测限，还通过实际样品的检测确定了本专利技术建立的方法具有实际可行性。本专利技术的快速检测食品中致病菌的方法，是以含有致病菌目标序列的DNA为模板，配置CSDPR反应体系，置于荧光分光光度计中，在分子信标探针和循环引物的作用下进行恒温扩增，根据扩增曲线及荧光增强速率实现食品中致病菌的定性或者定量检测；其中，分子信标探针的核苷酸序列(5’-3’)由A、B、C三部分依次组成，A和C为逆序互补配对，B为与目标序列互补配对的致病菌探针环序列。在一种实施方式中，所述A为TAAGACAT(SEQIDNO:1)、B为与目标序列互补配对的致病菌探针环序列、C为ATGTCTTA(SEQIDNO:2)。在一种实施方式中，所述分子信标探针的序列两端修饰有荧光基团和淬灭基团，FAM荧光素修饰于序列的5’端；Dabcyl淬灭基团修饰于序列的3’端。在一种实施方式中，所述含有致病菌目标序列的DNA是指含有检测靶核酸片段的核苷酸序列。在一种实施方式中，所述含有致病菌目标序列的DNA为致病菌的基因组DNA。在一种实施方式中，所述食品中致病菌，是金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌、志贺氏菌。在一种实施方式中，所述致病菌目标序列是指金黄色葡萄球菌的高度保守的16SrDNA片段中的一段序列、肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)高度保守的rfbE基因中的一段序列、沙门氏菌(Salmonella)侵袭蛋白基因(InvasionproteinA,invA)中的一段序列或者志贺氏菌(Shigella)侵袭性质粒抗原H基因(InvasionplasmidantigenH,ipaH)中的一段序列。目标序列不同，就可实现不同致病菌的检测。在一种实施方式中，所述与目标序列互补配对的致病菌探针环序列为(5’-3’)GAAGCAAGCTTCTCGTCC(SEQIDNO:3)，用于检测金黄色葡萄球菌。在一种实施方式中，所述与目标序列互补配对的致病菌探针环序列为(5’-3’)CCGAGTACATTGGCATCG(SEQIDNO:4)，用于检测EHEC。在一种实施方式中，所述与目标序列互补配对的致病菌探针环序列为(5’-3’)TCTGGCAGTACCTTCCTC(SEQIDNO:5)，用于检测沙门氏菌。在一种实施方式中，所述与目标序列互补配对的致病菌探针环序列为(5’-3’)TTTCCCTGCCCAGGGAGA(SEQIDNO:6)，用于检测志贺氏菌。在一种实施方式中，所述循环引物为能维持CSDPR循环反应的循环引物。在一种实施方式中，所述循环引物序列3’端的核苷酸为信标探针的A部分的核苷酸。在一种实施方式中，所述循环引物为TAAGACAT(SEQIDNO:7)、TTAAGACAT(SEQIDNO:8)、TTTAAGACAT(SEQIDNO:9)、TTTTAAGACAT(SEQIDNO:10)中的任意一种，用于检测金黄色葡萄球菌。添加同一浓度不同长度的引物没有对反应曲线产生明显的影响。在一种实施方式中，所述CSDPR反应体系中分子信标探针和循环引物的终浓度均为200nmol/L。在一种实施方式中，所述CSDPR反应体系中含有(体积比)：ddH2O78％，10×NEBBuffer210％，二甲亚砜(DMSO)6％，dNTPSolution1％，循环引物2％，分子信标探针2％，Klenow酶1％。在一种实施方式中，所述荧光分光光度计进行实时荧光CSDPR扩增的激发波长495nm，发射波长520nm，激发和发射狭缝均为5nm，光电倍增管电压700V。在一种实施方式中，所述恒温扩增的时间为15min，扩增温度37℃。在一种实施方式中，所述方法，还包括先测得的荧光信号强度(a.u.)与反应时间(s)，从而建立致病菌菌浓度与荧光信号增强速率之间的回归曲线关系；检测待测样品时，提取基因组DNA，进行CSDPR反应，得到荧光信号增强速率，代入回归曲线本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测食品中致病菌的方法，其特征在于，所述方法是以含有致病菌目标序列的DNA为模板，配置实时荧光循环链置换聚合酶反应(CSDPR)反应体系，置于荧光分光光度计中，在分子信标探针和循环引物的作用下进行恒温扩增，根据扩增曲线及荧光增强速率实现食品中致病菌的定性或者定量检测；其中，分子信标探针的核苷酸序列(5’‑3’)由A、B、C三部分依次组成，A和C逆序配对，B为与目标序列互补配对的致病菌探针环序列。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测食品中致病菌的方法，其特征在于，所述方法是以含有致病菌目标序列的DNA为模板，配置实时荧光循环链置换聚合酶反应(CSDPR)反应体系，置于荧光分光光度计中，在分子信标探针和循环引物的作用下进行恒温扩增，根据扩增曲线及荧光增强速率实现食品中致病菌的定性或者定量检测；其中，分子信标探针的核苷酸序列(5’-3’)由A、B、C三部分依次组成，A和C逆序配对，B为与目标序列互补配对的致病菌探针环序列。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，还包括先测得荧光信号强度(a.u.)与反应时间(s)，从而建立致病菌菌浓度与荧光信号增强速率之间的回归曲线关系；检测待测样品时，提取基因组DNA，进行CSDPR反应，得到荧光信号增强速率，代入回归曲线即可获知待测样品中致病菌的菌浓度。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子信标探针的序列两端修饰有荧光基团和淬灭基团，FAM荧光素修饰于序列的5’端，Dabcyl淬灭基团修饰于序列的3’端。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有致病菌目标序列的DNA是指含有检测靶核酸片段的核苷酸序列。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述食品中致病菌，是金黄色葡萄球菌、沙...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈晓芳，陈万明，庞月红，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32