一种用于捕食线虫丝孢菌分子鉴定的标准基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于捕食线虫丝孢菌的标准基因序列及鉴定方法，属物种分子鉴定领域。所述标准检测COX1基因，基因序列SEQ ID NO.1。使用线粒体细胞色素氧化酶I COX1基因通用引物PenF1,AspR1进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，再用特异引物序列PenF1‑chao：ATGCTAAAGACATTGGTA,AspR1‑chao：ACGTATACCTGGACTTC进行扩增，PCR产物经过琼脂糖胶进行验证后测序。根据COX1基因的序列差异，可以快速准确的鉴定捕食线虫丝孢菌。本发明专利技术可以快速、准确的鉴定该捕食线虫丝孢菌，为动植物线虫的防治提供有力的研究工具。

A standard gene for molecular identification of nematode trapping nematodes and its use

The invention relates to a standard gene sequence and an identification method for nematode trapping nematodes, belonging to the field of molecular identification of species. The standard for detection of COX1 gene, SEQ gene sequence ID NO.1. The use of mitochondrial cytochrome oxidase I gene COX1 universal primers PenF1, AspR1 polymerase chain reaction (PCR) amplification, with specific primers of PenF1 chao:ATGCTAAAGACATTGGTA, AspR1 chao:ACGTATACCTGGACTTC amplified PCR products by agarose gel were verified after sequencing. According to the sequence difference of COX1 gene, the nematode trapping nematode could be rapidly and accurately identified. The present invention can rapidly and accurately identify the nematode trapping nematode, and provides a powerful research tool for preventing and controlling nematodes in animals and plants.

【技术实现步骤摘要】
一种用于捕食线虫丝孢菌分子鉴定的标准基因及其应用
本专利技术涉及物种分子鉴定领域，具体涉及一种用于捕食线虫丝孢菌分子鉴定的标准基因及其应用。
技术介绍
植物寄生线虫病是一类在世界范围内普遍发生的植物病害，目前已知的根结线虫种类就有70多种，危害3000多种植物，全球每年因线虫病造成的损失高达1000多亿美元。在线虫和真菌复杂的相互关系中，专门有一类真菌，它们通过营养菌丝特化的捕食器官来捕捉线虫，这一类真菌称为捕食线虫丝孢菌。根据Zhang等2014年发表的最新版专著，现今已知的捕食线虫丝孢菌有3个属96个种，分别是Arthrobotrys属54个种，Drechslerella属14个种，Dactylellina属28个种。随着漫长的进化演变，其菌丝体为适应生存环境，营养菌丝变态为各种形态独特、结构精巧的捕食器官，如粘性球、粘性网和收缩环等结构，以便捕食线虫。就目前来说，生物防治线虫无疑是最可靠最安全的手段，故捕食线虫丝孢菌在线虫生物防治领域中扮演者重要的角色，具有特殊的生态学意义和经济价值。因捕食线虫丝孢菌包含无性型属种多，物种形态特征多样及其形态可塑性，以及潜在的多元生活史，使得某些物种间没有明显的显微结构差异，且目前对该类真菌的分子系统发育研究不足，故研究者对该类真菌分子系统发育及物种鉴定等方面的问题争议不断，也给防治线虫的生物制剂研发带来诸多困扰。因此，急需标准基因来建立其快速的分子鉴定，通过形态研究和分子数据相结合的方法来解决其鉴别和分类问题。
技术实现思路
为克服形态学鉴定捕食线虫丝孢菌存在的不足，本专利技术提供了一种捕食线虫丝孢菌分子鉴定的标准基因序列及鉴定方法，可以快速准确地将该捕食线虫丝孢菌易混淆物种鉴定出来，从而为线虫的防治提供快速和有效的鉴定工具。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种用于捕食线虫丝孢菌分子鉴定的标准基因及其应用，包括COX1标准基因片段的建立和样品的鉴别步骤；其中：（1）根据DNA条形码技术原理，采用PCR扩增方法，确保条带的纯度及可靠性。测序结果通过手工校对、序列拼接，并确保所得序列为标准序列。从采集的捕食线虫丝孢菌样品提取基因组DNA，利用引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增出样品的COX1基因，将扩增产物测序后分析比对，SEQIDNO.1样本引物序列扩增样品的COX1基因序列片段作为标准基因。（2）样品的鉴别：通过将待鉴别的样品序列与标准基因进行比对，基于同源性和基于聚类分析的系统发生树法设立鉴定规则来鉴别物种，获得序列间的相似性，相似度最高或匹配度最高或遗传距离最近的对应物种即为待鉴别的物种；具体如下：a.基于同源性鉴定规则来鉴别物种根据测序结果，如果与所述基因序列SEQIDNO.1核苷酸差异个数在10个以下，即可判断所述的待测样品为捕食线虫丝孢菌的某个物种。b.基于聚类分析的系统发生树法设立鉴定规则来鉴别物种将标准基因序列和待鉴定的样品序列与捕食线虫丝孢菌的COX1基因序列合并应用MEGA或PAUP软件构建NJ系统发育树，检验未鉴定样品的DNA条形码序列与标准基因序列聚类在一起的物种，若未知样品与数据库中的物种构成单支系，则鉴定为该物种。本专利技术的优点在于：1、优选COX1基因作为最适合鉴别捕食线虫丝孢菌的DNA条形码，相比于其他基因，COX1序列具有通用、易比对的特点。2、建立了捕食线虫丝孢菌的标准基因序列和样品的鉴别方法，相比于传统的形态学鉴定方法，大大提高了鉴定效率。该方法对于样品的完整程度要求低，鉴别指标能够量化，这对于及时鉴定捕食线虫丝孢菌提供了有效的依据。此外，运用基于聚类分析的系统发生树法设立鉴定规则进行鉴定，其鉴定的可靠性和准确性也大大优于常规的分子鉴定方法，弥补了该类捕食线虫丝孢菌分子鉴定的不足。附图说明：图1是待鉴定样品序列及形态学混淆种和COX1标准基因序列基于Kimura-2-parameter模型的遗传距离构建的NJ树。具体实施方式：下面结合具体的实例对本专利技术做进一步说明：实施例1：待测样品与捕食线虫丝孢菌DNA条形码鉴别标准基因片段的同源性鉴定1、捕食线虫丝孢菌标本的采集与保存：采集的9份来自云南省的样品。2、提取捕食线虫丝孢菌基因组DNA：采用改进过的CTAB法提取基因组DNA，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.5μg/μl。3、扩增DNA片段，进行聚合酶链式(PCR)反应，即用通用引物进行扩增，外引物对序列为：正向引物PenF1:5'GACAAGAAAGGTGATTTTTATCTTC3'；反向引物AspR1:5'GGTAATGATAATAATAATAATACAGC3'；4.根据根据权利要求2所述的特异性引物，其特征在于内引物序列为：正向引物PenF1-chao:5'ATGCTAAAGACATTGGTA3'；反向引物AspR1-chao:5'ACGTATACCTGGACTTCT3'。PCR反应体系为25μl：ddH2O18μl、PCRBuffer2.5μl、MgCl22.5μl，dNTPs0.5μl，TaqDNA聚合酶0.5μl、DNA模板1μl，不含染料；外引物扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性40s，37℃退火55s，如此低温退火2-3个循环，再将最终退火温度定格于50℃，55s，72℃延伸1min，如此进行30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。内引物扩增条件为：95℃预变性5min，94℃变性40s，退火温度为55℃-50.5℃逐渐降低0.5℃，共计11个循环，最后将退火温度定格在50℃，25个循环，72℃延伸1min，如此进行30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。5、扩增产物上样，用1.0%的琼脂糖凝胶、1×TBE电泳液中电泳检测，使用DNAmarker检测PCR片段大小。若出现明显清晰的300-400bp大小的条带，且无杂带，送测序。6、首先用软件Chromas中检查测序后得到的序列峰图质量，确定峰图质量达到数据分析的要求之后，用DNASTAR软件包中的SeqMan进行正反向序列的拼接。将测序结果进行手工校对、序列拼接，如果目的基因片段与所述基因序列SEQIDNO.1核苷酸差异个数在10个以下，即可判断所述的待测组织即为捕食线虫丝孢菌。实施例2：运用系统发生树法设立鉴定规则来鉴别物种1、采用实施例1中所述步骤得到待测样品的序列，将标准基因序列和待鉴定的样品序列与待测样品的COX1序列合并应用MEGA基于Kimura-2-parameter模型重复1000次构建系统发育树，未鉴定样品的DNA条形码序列与标准基因序列聚类在一起，与非捕食线虫丝孢菌Pseudotripoconidiumsinensis的序列呈现明显的分歧，说明待鉴定样品可以鉴定为捕食线虫丝孢菌。与传统的形态学鉴定方法相比，本专利技术获得的基因序列和运用的方法有利于实现对捕食线虫丝孢菌快速和准确的鉴定。SEQUENCELISTING<110>云南大学<120>一类捕圆盘菌食线虫真菌鉴定的标准基因及其应用<130>2017<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>352<212>DNA&本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种捕食线虫丝孢菌的DNA条形码标准基因序列，其特征在于核苷酸序列为序列表中序列1所示的DNA分子序列。

【技术特征摘要】
1.一种捕食线虫丝孢菌的DNA条形码标准基因序列，其特征在于核苷酸序列为序列表中序列1所示的DNA分子序列。2.应用权利要求1所述的标准基因进行捕食线虫丝孢菌分子鉴定的方法，包括以下4个步骤：(1)从样品菌丝中提取基因组DNA；(2)以步骤(1)所提取的基因组DNA为模板，用捕食线虫丝孢菌COX1通用外引物扩增，再用特异性内引物进行聚合酶链式反应；(3)对步骤(2)扩增得到的DNA产物进行测序；(4)将测序结果进行人工拼接和校正，与基因序列表中的捕食线虫丝孢菌的代表菌株序列SEQIDNO.1进行同源性比对，若核苷酸差异个数在10个以下，即可将该样品鉴定为捕食线虫丝孢菌。3.根据权利要求2所述的COX1基因通用引物，其特征在于外引物序列为：正向引物PenF1:5'GACAAGAAAGGTGATTTTTATCTTC3'；反向引物AspR1:5'GG...

【专利技术属性】
技术研发人员：张颖，张克勤，张云润，董建勇，蒋力力，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：云南,53