柏树微卫星分子标记组合、引物筛选方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一组多态性柏树叶绿体微卫星分子标记组合，其引物组合及筛选方法、和应用，属林业分子生物学技术领域。应用中，鉴定柏树叶绿体微卫星分子标记引物多态性的方法包括：对设计的引物对正向引物的5’端加上M13尾巴序列与特异反向引物及带有荧光标记的通用型M13引物和基因组DNA混合并进行PCR扩增、电泳分离测序得到柏树叶绿体微卫星分子标记的多态性引物；鉴定柏树亲缘关系的方法包括：提取柏树的基因组DNA；采用柏树叶绿体微卫星分子标记的多态性引物进行PCR扩增、电泳分离，毛细管电泳测序，统计STR多态性，多态性引物能够反映柏树细胞质基因组的遗传信息，可用于柏树的种质资源分类、遗传多样性分析等研究。

Molecular sieve combination and primer screening methods for cypress and its application

The invention discloses a set of polymorphic cypress chloroplast micro satellite molecular marker combinations, primer combinations and screening methods and applications thereof, belonging to the technical field of forestry molecular biology. In the application, including the identification of cypress chloroplast microsatellite marker polymorphism: to design primers for the 5 'end of the forward primer plus M13 tail sequence and specific reverse primers and fluorescently labeled with universal M13 primers and genomic DNA were mixed and polymorphic primers PCR amplification, sequencing electrophoresis separation from cypress chloroplast microsatellite marker; genetic relationship identification method including cypress: extraction of genomic DNA from cypress; using polymorphic primers cypress chloroplast microsatellite markers were amplified by PCR, electrophoresis, capillary electrophoresis sequencing, statistical STR polymorphism, genetic information of polymorphic primers can reflect the cypress Cytoplasmic Genome, can be used in the study of classification germplasm resources, genetic diversity analysis of cypress.

【技术实现步骤摘要】
柏树微卫星分子标记组合、引物筛选方法及其应用
本专利技术涉及林业分子生物
，具体涉及柏树分子标记技术，更具体涉及一种柏树微卫星分子标记及其筛选方法和在鉴定柏树亲源关系及品种鉴定和辅助育种中等领域的应用。
技术介绍
柏科植物很多种类是主要的木材原料，并且被广泛地应用于园艺、医药等领域。柏树全身是宝，树脂、树油、果实、枝节、树叶均能入药使用。而以侧柏的种子柏子仁和侧柏叶在临床上应用得最为广泛。种仁：甘，平，可养心安神，止汗，润肠。枝梢及叶：苦涩，微寒凉血止血，生发乌发，可治吐血、痢疾、痔疮、烫伤等症。中国传统中医学认为，柏树发出的芳香气体具有清热解毒、燥湿杀虫的作用，可祛病抗邪，培养人体正气。据测试，其主要成分为菘萜、柠檬萜。这些天然物质不仅能杀灭细菌、病毒，净化空气，而且具有松弛精神、稳定情绪的作用。人们吸入柏树的香味后，可使血压下降，大脑血流量减少，抑郁情绪得到缓解。柏树的根、杆、疙头都合有挥发油，名曰柏木油(Cedarwoodoil)或柏香油。柏木原油经减压蒸馏而得柏木精油，出口一般叫B、P、C柏木精油，它的主要成分是柏木醇(柏木脑)、柏木烯和少量的萜烯类化合物。柏木精油广泛应用于香料、医药和国防工业的原料。柏科种植资源丰富，是分布最广的针叶植物，除了南极洲以外世界各地都有它的分布，包括27个属(其中有17个单型属)大约有142个种。长期的自然进化和选择过程，产生了丰富的遗传变异资源，又称种植资源。种质资源的准确区分与鉴定是进行良种选育和遗传改良的基础。但是关于柏科资源分布、种群遗传多样性和种质资源保护等方面的研究尚未见报道，对于柏科植物的种质资源鉴定、分子辅助选育等方面研究尚属空白。微卫星有助于鉴定柏树品系，并区分出伪品。同时，利用微卫星标记对柏树分子育种的研究尚且很少，其中一个重要的限制因素就是分子标记技术的缺乏，尤其是柏科的基因组巨大而复杂，低成本、高通量的分子标记技术的建立对于柏科遗传鉴定、分子辅助选育有重要价值。微卫星(Microsatellite)又称作短串连重复(ShortTandemRepeats，STRs)、简单重复序列(SimpleSequenceRepeat，SSRs)、简单序列长度多态性(SSLP)。是指一类遍布于生物基因组中的由几个核苷酸对(称为核心序列，一般为1～6bps)为重复单位组成的简单串联重复。其重复次数在同一物种不同的遗传型间是高度可变的，但这段重复的两端却是相对保守的单拷贝序列，与其它标记技术相比，具有以下特点：首先，在每个微卫星DNA两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，尤其在亲缘关系相近的物种间是保守的，而且在一些紧密相关的物种中其重复单位和重复次数具有一定的相似性。其次，这些小的、串联排列的重复序列经常是通过核苷酸链的滑动错配或者其它未知的过程来改变它们的长度，从而导致微卫星在数量上的差异。微卫星的突变率高：每代每个配子的每个位点有25每个配子的～15每个配子突变，因此造成了它们的多态性。微卫星寡聚核苷酸的重复次数在同一物种的不同基因型间差异很大。微卫星通常是复等位的，代表每个微卫星位点的等位基因数目高度可变。微卫星DNA的多态性比RFLP显著增高据此设计引物，即可通过PCR技术分析核心序列重复次数的变异，在不同的遗传型间检测到多态。根据重复单元的构成，微卫星DNA序列被分为3种类型：单一型(pure)，复合型(compound)和间断型(interrupted)作为一种分子标记，微卫星DNA具有以下特点：广泛分布于真核生物的基因组中，据估计每6到10kb长度中就有1个微卫星位点；核心序列的重复次数在个体间呈高度变异性，多态性信息容量高：呈共显性，遵循盂德尔法则遗传；选择中性等等。微卫星标记具有较高的等位基因多样性和共显性的特点，且其具有数量多、研究成本较低、操作较方便、重复性高等优点，使其成为广泛被使用的分子标记之一。基于以上特点，微卫星DNA被广泛开发用于植物遗传连锁图谱的构建、基因定位、品种鉴定和种质保存、数量性状基因的分析、分子标记辅助育种、构建指纹图谱、遗传多样性及物种进化与亲缘关系等方面的研究。由于植物细胞除细胞核遗传外，还具有细胞质遗传。细胞器基因组具有非重组性和单亲遗传等特点，所以被广泛地应用于研究植物生态学和遗传进化的研究。在植物中，线粒体基因组差异较大，分子内重组水平较高，在其广泛应用中有很大的困难；而叶绿体基因组特点(1)分子量小，多拷贝，结构简单，多为闭环双联DNA，大小为120～210Kb；(2)原核性，序列相当保守，进化速率缓慢，仅为nDNA的1/5，在较多植物类群有不同程度种内变异：(1)单亲遗传，不参加基因重组(不受选择压力)，切不收基因的重叠、缺失及假基因的干扰，有独立的进化路线，不依赖其他任何数据可建立分子系统树，查明植物进化历史。这些特点有利于对其进行分析，包括物理图谱的构建和特定基因的分离、鉴定和序列测定)，适合用于具有较高分类单位的系统演化研究，在植物的种间、属间和科间在系统发育方面比nDNA和线粒体mDNA有更加广泛的应用性。对CPDNA进行分析科从历史和系统发育的角度解释生物多样性可靠和准确的信息。在柏科上大多数物种的叶绿体基因组是父系遗传的，叶绿体微卫星标记可用于直接检测花粉流，其通用性会较强，所以叶绿体微卫星标记可以应用于柏树种间和种内的遗传多态性检测。因此，开发柏树叶绿体多态性微卫星分子标记的应用，对进行柏树生态群体遗传结构多样性分析、基因流动、进化、物种演化、胞质遗传特性、种群分类、亲缘关系谱系构建、品种鉴定、辅助选育、和种质资源保护具有重要意义。而现有技术中目前在柏树方面的分子标记开发还比较少，并未记载有针对柏树的细胞核DNA外的其他物质用于鉴定柏树的种质资源，无法满足当前柏树遗传学研究和育种研究的生产和科研要求。柏科植物的基因组较为复杂并且巨大，所以要开发出一些有效的分子标记并非易事。分子标记的种类很多，但是有些分子标记操作比较麻烦，而且成本比较高，且标记的效果也参差不齐，稳定高效的分子标记是较为需要得到的。柏树的大规模商业化应用为我们提出了我们开发高效、操作简单，检测精确性高、稳定高效的辅助选育手段为以后的利用做好基础性研究工作的重要任务。
技术实现思路
为了解决现有技术中鉴定柏树种质资源有效手段缺乏的问题，本专利技术的目的是提供一组在柏树可以直接应用于种内和种间，具有很好的通用性和实用性的高效、操作简单，检测精确性高、稳定高效的叶绿体多态性微卫星分子标记、其筛选方法和扩增引物、品种鉴定方法和亲源关系鉴定的方法。一方面，本专利技术提供了一种柏树多态性微卫星分子标记的组合，其中，该柏树微卫星多态性分子标记的组合选自编号为N1、N2、N4、N6、N8、N9、N10、N11、N13、N14、N15、N16、N18、N19、N20、N22、N23、N25、N27、N28、N29、N31、N32、N33、N34、N35，核苷酸序列分别如SEQNo.1～SEQNo.26所示。26个通用型柏树微卫星分子标记的组合的部分组合或全部组合本专利技术的微卫星多态性分子标记的组合，其中，柏树多态性微卫星分子标记的组合是根据从核苷酸序列分别如SEQNo.1～SEQNo.26所示的各编号的26个通用型柏树微卫星分子标记筛选获本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种柏树多态性微卫星分子标记的组合，其特征在于，所述柏树多态性微卫星分子标记的组合为选自编号为N1、N2、N4、N6、N8、N9、N10、N11、N13、N14、N15、N16、N18、N19、N20、N22、N23、N25、N27、N28、N29、N31、N32、N33、N34、N35，核苷酸序列分别如SEQ No.1～SEQ No.26所示的26个通用型柏树微卫星分子标记的部分组合或全部组合。

【技术特征摘要】
1.一种柏树多态性微卫星分子标记的组合，其特征在于，所述柏树多态性微卫星分子标记的组合为选自编号为N1、N2、N4、N6、N8、N9、N10、N11、N13、N14、N15、N16、N18、N19、N20、N22、N23、N25、N27、N28、N29、N31、N32、N33、N34、N35，核苷酸序列分别如SEQNo.1～SEQNo.26所示的26个通用型柏树微卫星分子标记的部分组合或全部组合。2.根据权利要求1所述的柏树多态性微卫星分子标记的组合，其特征在于所述柏树多态性微卫星分子标记的组合是根据从核苷酸序列分别如SEQNo.1～SEQNo.26所示的各编号的26个通用型柏树微卫星分子标记筛选获得的遗传多态性指标得分较高的的分子标记的组合，所述多态性分子标记组合中的分子标记数量为4～10个，或者可优选的，所述多态性分子标记组合中的分子标记数量为6～8个，所述遗传多态性指标包括等位基因数(numberofalleles，Na)、有效等位基因数(effectivenumberofalleles，Ne)、香农-威纳指数(Shannon-WienerIndex，I)、多态性(diversity，h)、无偏差多态性(unbiaseddiversity，uh)。3.根据权利要求1或2所述的柏树多态性微卫星分子标记的组合，其特征在于，所述通用型柏树微卫星分子标记的组合中，所述编号为N1的微卫星分子标记的重复序列为(AC)6，所述编号为N2的微卫星分子标记的重复序列为(AT)5，所述编号为N4的微卫星分子标记的重复序列为(AAGGACAAA)5，所述编号为N6的微卫星分子标记的重复序列为(TA)5，所述编号为N8的微卫星分子标记的重复序列为(AT)6，所述编号为N9的微卫星分子标记的重复序列为(TA)12，所述编号为N10的微卫星分子标记的重复序列为(CA)5，所述编号为N11的微卫星分子标记的重复序列为(AT)6，所述编号为N13的微卫星分子标记的重复序列为(AT)s，所述编号为N14的微卫星分子标记的重复序列为(AT)6，所述编号为N15的微卫星分子标记的重复序列为(AT)6，所述编号为N16的微卫星分子标记的重复序列为(AT)5，所述编号为N18的微卫星分子标记的重复序列为(AC)6，所述编号为N19的微卫星分子标记的重复序列为(AGA)6，所述编号为N20的微卫星分子标记的重复序列为(AT)5，所述编号为N22的微卫星分子标记的重复序列为(CA)5，所述编号为N23的微卫星分子标记的重复序列为(AT)6，所述编号为N25的微卫星分子标记的重复序列为(TA)5，所述编号为N27的微卫星分子标记的重复序列为(AT)7，所述编号为N28的微卫星分子标记的重复序列为(AT)7，所述编号为N29的微卫星分子标记的重复序列为(TA)5，所述编号为N31的微卫星分子标记的重复序列为(AT)5，所述编号为N32的微卫星分子标记的重复序列为(AT)5，所述编号为N33的微卫星分子标记的重复序列为(TCT)5，所述编号为N34的微卫星分子标记的重复序列为(TCT)5，所述编号为N35的微卫星分子标记的重复序列为(AT)6。4.根据权利要求1所述的柏树多态性微卫星分子标记的组合，其特征在于，所述柏树通用型微卫星分子标记为叶绿体微卫星分子标记。5.根据权利要求1所述的柏树多态性微卫星分子标记的组合，其特征在于，所述编号为N1、N2、N4、N6、N8、N9、N10、N11、N13、N14、N15、N16、N18、N19、N20、N22、N23、N25、N27、N28、N29、N31、N32、N33、N34、N35，核苷酸序列分别如SEQNo.1～SEQNo.26所示的26个通用型柏树微卫星分子标记的引物对序列分别为：N1的正向引物为TTCTAGCTCGCACCCAAACT，反向引物为TTGTTTCGCCGATATGTTCA；N2的正向引物为TGGTCATACCATTGCTGTTCA，反向引物为TGGGCTACTCTACGTGCTTT；N4正向引物为TCGGAAGAAGAAGATGATATGTAGC，反向引物为CCCCAGATATGGAACTTTTGG；N6正向引物为GGGAACAACCAGAATTGGAA，反向引物为GCCACTTTTATGGCACGACT；N8正向引物为GGGAAGCGGAAAGCTATTTT，反向引物为GGTAATCCACAGCAGCCAAT；N9正向引物为CAAATTTCTCGCCAAGCTGT，反向引物为TGATTTCATCGGGTCGAATA；N10正向引物为TCGGGAACGAAAGAGAAAGA，反向引物为ACATAGATGTTATGGAGCAGAGC；N11正向引物为TCCAATCTAGAACATCTCATCCAG，反向引物为CAGTGCTCTACCTAATCTGAAAGC；N13正向引物为TCGCCGCAATACTCCTAATC，反向引物为ATTCCGAAAAGATGGCTTCA；N14正向引物为TCCATATCTGGTGGACAGGA，反向引物为GGGTTTTGGTCTTCTTCTTCG；N15正向引物为CCAGGTCGAGACAAGTGGAT，反向引物为GAAACCAATGCCCTAAGCAA；N16正向引物为ATTCGATCCCTATCCGGTCT，反向引物为ACCAGAGCCATCAACCACTC；N18正向引物为AAAATCGCCGCAATACTCCT，反向引物为ATTCCGAAAAGATGGCTTCA；N19正向引物为CGGACCTACCGACAGAACTC，反向引物为CCGAAGAAATAAGAAGCTGTATAGG；N20正向引物为CTTGCTCCTAGCCATGAAAA，反向引物为TGATTTCATCGGGTCGAATAG；N22正向引物为CTGTGATGCCGTTGATATTGA，反向引物为TGCCCATTATCCCTCTGTTC；N23正向引物为TCCTCTGCGATCTTTTATAGGG，反向引物为GGGAAGGATTGTTGGATTGA；N25正向引物为CCTCATACGGCTTCTCGTTC，反向引物为AAAATGAACCCCGAAGGATT；N27正向引物为TGATTTCATCGGGTCGAATA，反向引物为CAAATTTCTCGCCAAGCTGT；N28正向引物为GAGATGAACGCAGAGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄丽莎，张玉平，曹均，毛建丰，刘国彬，
申请(专利权)人：北京林业大学，北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京,11