用于调节CAR诱导的免疫细胞活性的方法技术

本发明专利技术涉及调节用于免疫治疗的工程化免疫细胞(如，嵌合抗原受体T细胞)的活化水平的方法。本发明专利技术还涉及通过本方法获得的细胞，该细胞优选包含可调节的/可调的嵌合抗原受体，用于在治疗性或预防性治疗中使用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于调节CAR诱导的免疫细胞活性的方法
本专利技术涉及调节CAR(嵌合抗原受体)的转导信号的方法，该转导信号的水平决定工程化免疫细胞(如，免疫治疗中使用的嵌合抗原受体T细胞)的活化水平。特别地，专利技术人已经开发了一种分子开关系统和新的CAR结构体，使得在给予可溶性化合物(其诱导抑制性结构域和激活信号结构域的共定位)时，对所述细胞进行可调节的激活，尤其是通过化学诱导的二聚化(CID)。因此，由嵌合抗原受体(CAR)触发的工程化免疫细胞的活化可以随时通过抑制性信号结构域进行监测或分流。本专利技术为可调节的和更安全的过继性免疫治疗的前景开辟了道路。
技术介绍
涉及体外产生的自体抗原特异性T细胞的转移的过继性免疫治疗是一种有前景的治疗癌症的策略。可以通过扩增抗原特异性T细胞或通过基因工程化T细胞的重定向来产生用于过继性免疫治疗的T细胞(Park，Rosenbergetal.2011)。病毒抗原特异性T细胞的转移是用于治疗移植相关性病毒感染和罕见病毒相关性恶性肿瘤的成熟的方法。类似地，已经显示，肿瘤特异性T细胞的分离和转移在治疗黑素瘤方面是成功的。通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的遗传转移，已经成功产生了T细胞的新特异性。CAR是合成受体，由单个融合分子中与一个或多个信号结构域相关联的靶向部分组成。CAR已经成功地使得T细胞针对来自各种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞表面上表达的抗原(Jena，Dottietal.2010)进行重定向。第一代CAR修饰的T细胞在临床前试验中取得了成功，并进入了I期临床试验。对卵巢癌、神经母细胞瘤和各种类型的白血病和淋巴瘤的临床试验已经开始(https：//clinicaltrials.gov/)。临床试验显示，几乎没有抗肿瘤活性的证据，其中活化、持续性和归巢回癌组织均不足。不同研究已报道，部分第一代CAR在没有共刺激作用的情况下导致无反应性和体内扩增失败。为了克服这些局限性，设计了第二代和第三代CAR修饰的T细胞，以增强临床前试验中CAR修饰的T细胞的激活信号、增殖、细胞因子的产生和效应子功能(effectorfunction)。开发了第二代CAR，以在胞内域(endodomain)结合一种或多种共刺激分子(如，CD28、OX40和4-1BB)的胞内结构域，并且这些改善了抗原特异性T细胞的激活和扩增。第三代CAR包括共刺激胞内域的组合。现在，第二代和第三代CAR修饰的T细胞都已进入临床试验。第一临床试验涉及表达CAR的T细胞，其将抗CD19结合结构域与4-1BB共刺激结构域和CD3zeta组合作为激活信号结构域，导致了一些患者症状完全缓解，这种缓解一直持续到治疗后的10个月。发现CAR修饰的T细胞在这些患者中扩增了3倍数(3log)，渗入并溶解癌组织。有趣的是，这些细胞的一部分显示出用于预防性肿瘤复发的T细胞记忆表型。虽然这些CAR修饰的T细胞产生了显著的治疗效果，但是在第一次输注CAR-修饰的T细胞后3周，它们的活性引起了危及生命的肿瘤溶解。最近报道的不良事件强调，在使用第二代和第三代CAR修饰的T细胞时，需要特殊的预防措施。一名患者在环磷酰胺化疗并随后输注识别抗原ERBB2(HER-2/neu)的CAR-修饰的T细胞5天后死亡(Morganetal.2010)。毒性导致了促炎细胞因子的在临床上的显著释放、肺部毒性、多器官衰竭和患者的最终死亡。这种和其他不良事件强调使用CAR-修饰的T细胞时谨慎的必要性，因为与针对肿瘤相关性抗原的抗体不同，这些细胞在短时间内不会从体内清除。存在多项正在进行的研究，以开发更安全的基于CAR的免疫治疗。多项研究报告了旨在提高T免疫治疗的功效和安全性的多种系统。在健康人中的T细胞介导的免疫力包括由共刺激信号和抑制性信号之间的平衡调节的多个顺序步骤，这两种信号微调免疫反应。称为免疫检查点的抑制性信号(如，CTLA-4-或PD-1)对于维持自身耐受性至关重要，并且还限制免疫介导的侧支组织损伤(Dolanetal，2014)。最近，设计了抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其具有的目标是在遇到脱靶细胞时将抑制T细胞功能上。iCAR由融合至T细胞抑制性信号结构域的抗原特异性单链可变片段(scFv)构成。表达肿瘤相关抗原而不是正常组织抗原的细胞将诱导T细胞活化、细胞毒性和细胞因子信号以杀死在靶细胞(ontargetcell)。在研究中(Federovetal.2013)，基于CTLA-4-或PD-1-的iCAR表现出选择性限制通过内源T细胞受体或活化嵌合受体诱导的细胞因子分泌、细胞毒性和增殖。因此，为了发挥功能，iCAR技术依赖于2种抗原的初步选择：一种肿瘤相关抗原和一种正常组织抗原。此外，PD-1或CTLA-4的抑制效果仅在脱靶细胞(off-targetcell)上运行。在Buddeetal.(2013)中描述了另一系统，其中CD20嵌合抗原受体与诱导型胱天蛋白酶9(iC9)自杀开关(suicideswitch)相结合。在申请US2014/0286987中，在前药AP1903(他克莫司)的存在下，通过结合到突变的FK506结合蛋白(FKBP1)使得后一种基因具有功能性。由Bellicum公司发起的临床试验正在进行，其中上述半胱天冬酶技术(CaspaCIDTM)被工程化到第三代CART细胞靶向的GD2中。病毒转导将DNA从载体转移至靶细胞中，并且该载体衍生的DNA引导表达化学诱导的二聚化(CID)和辅助蛋白。在AP1903药物存在下，将产生CID蛋白的二聚化，从而开启信号级联。在由给予的T细胞引起严重危及生命的毒性的情况下，AP1903将被注入以触发CaspaCIDTM启动的细胞的快速破坏和消除。一个重要的特征是，该表达限于细胞的细胞质。此外，根据Bellicum系统，不存在调节T细胞的活性的可能，因为与药物接触的CaspaCIDTM的表达导致T细胞死亡。申请WO2014/152177中描述了一种类似的基于多聚化剂的凋亡诱导系统。需要一种基于CAR的免疫治疗技术，其通过添加可溶性化合物能够抑制或调节嵌合抗原受体(CAR)免疫细胞的活性而不会杀死所述细胞；这是灵活的，因为可溶性化合物的作用可以是细胞内或细胞外的，并且与在靶/脱靶细胞选择无关。本专利技术在此提供了此类免疫治疗，在细胞毒性的情况下(即需要时)，该免疫治疗通过给予特定的可溶性化合物可以特异性地抑制/调节活化。
技术实现思路
在一方面，本专利技术提供了通过给予可溶性化合物以调节嵌合抗原受体-工程化免疫细胞，如CAR-T细胞的活化水平的方法。在优选的方面，可溶性化合物可以是小分子(如，雷帕霉素类似物(rapalog))或双特异性抗体，其触发至少一个结合结构域的共定位，并因此通过抑制性信号结构域的作用增强CAR-工程化免疫细胞的调节。根据本专利技术的一个方面，包含结合(或二聚化)结构域的抑制性膜蛋白(IMP)与CAR在免疫细胞中共表达。CAR和IMP，尤其通过包含在CAR内的第二结合结构域，使得相对于可溶性化合物具有反应性，由此通过IMP具有的抑制性信号结构域的二聚化或配体识别，以及CAR具有的信号转导结构域的二聚化或配体识别而允许共定位，从而具有降低CAR活化的效果。抑制性信号结构域优选为程序性死亡本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，所述方法包括以下步骤：(a)利用编码嵌合抗原受体(CAR)的至少第一多核苷酸转染免疫细胞，所述嵌合抗原受体可以通过外部配体在体内和/或体外激活；所述CAR包含第一结合结构域；和(b)利用编码工程化的抑制性膜蛋白(IMP)复合物的至少第二多核苷酸进一步转染所述免疫细胞，所述工程化的抑制性膜蛋白复合物包含至少一种胞内抑制性信号结构域和一种第二结合结构域，以使得所述免疫细胞共表达所述CAR和所述抑制性膜蛋白(IMP)复合物；以及(c)使所述工程化免疫细胞与所述外部配体接触，以便通过所述CAR转导信号；并且随后(d)通过添加可溶性化合物以降低所述CAR的所述信号转导的水平，所述可溶性化合物结合所述IMP的结合结构域和所述CAR分子的结合结构域以共定位所述IMP和所述CAR，由此调节所述工程化免疫细胞的活化水平。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.07 DK PA2014706231.一种用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，所述方法包括以下步骤：(a)利用编码嵌合抗原受体(CAR)的至少第一多核苷酸转染免疫细胞，所述嵌合抗原受体可以通过外部配体在体内和/或体外激活；所述CAR包含第一结合结构域；和(b)利用编码工程化的抑制性膜蛋白(IMP)复合物的至少第二多核苷酸进一步转染所述免疫细胞，所述工程化的抑制性膜蛋白复合物包含至少一种胞内抑制性信号结构域和一种第二结合结构域，以使得所述免疫细胞共表达所述CAR和所述抑制性膜蛋白(IMP)复合物；以及(c)使所述工程化免疫细胞与所述外部配体接触，以便通过所述CAR转导信号；并且随后(d)通过添加可溶性化合物以降低所述CAR的所述信号转导的水平，所述可溶性化合物结合所述IMP的结合结构域和所述CAR分子的结合结构域以共定位所述IMP和所述CAR，由此调节所述工程化免疫细胞的活化水平。2.根据权利要求1所述的用于调节活化水平的方法，其中，所述CAR转导的所述信号是所述免疫细胞的激活并且所述免疫细胞被激活。3.根据权利要求1或权利要求2所述的用于调节活化水平的方法，其中，所述IMP和所述CAR的共定位具有关闭所述CAR信号转导的作用。4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，其中所述IMP复合物包含至少两个跨膜多肽，每个跨膜多肽包含由所述可溶性化合物结合的结合结构域。5.根据权利要求1至4中任一项所述的用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，其中所述第一和所述第二结合结构域是CID结合结构域。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中降低活化水平的所述步骤d)，通过在所述抑制性膜蛋白(IMP)复合物的两个不同的多肽上生成的两个抑制性信号结构域IL10RA和IL10B的共定位来进行。7.根据权利要求1至5中任一项所述的用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，其中降低活化水平的所述步骤d)通过所述IMP和所述CAR结构经由所述可溶性化合物的共定位来进行。8.根据权利要求1-5或权利要求7中任一项所述的用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，其中所述CAR包含第二结合结构域，以便所述可溶性化合物可以将所述CAR与所述IMP结合在一起。9.根据权利要求1-8中任一项所述的用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，其中所述方法进一步包括在步骤b)时将所述免疫细胞输注于患者体内的步骤。10.根据权利要求1-9中任一项所述的用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。11.根据权利要求1-10中任一项所述的用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，其中所述CAR是单链CAR。12.根据权利要求1-10中任一项所述的用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，其中所述CAR是多链CAR。13.根据权利要求1-12中任一项所述的用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，其中所述结合结构域是细胞外的。14.根据权利要求1-12中任一项所述的用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，其中两个所述结合结构域均是细胞内的。15.根据权利要求1-5或7-14中任一项所述的用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，其中所述抑制性信号结构域来自PD1。16.根据权利要求1-15中任一项所述的用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，其中所述可溶性化合物是小分子。17.根据权利要求16所述的用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，其中所述可溶性化合物是雷帕霉素类似物。18.根据权利要求17的任一项所述的用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，其中，所述小分子是雷帕霉素。19.根据权利要求1-18中任一项所述的用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，其中，所述第一和所述第二结合结构域具有与SEQIDNO14和SEQIDNO15至少80％的同一性。20.根据权利要求1-19中任一项所述的用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，其中，所述可溶性化合物是双特异性抗体。21.用于生产工程化免疫细胞的方法，通过CAR的所述工程化免疫细胞的活化水平由抑制性膜蛋白(IMP)复合物控制，所述方法包含下列步骤：(a)采用编码嵌合抗原受体(CAR)的至少第一多核苷酸转染免疫细胞；以及(b)采用编码工程化抑制性膜蛋白(IMP)复合物的至少第二多核苷酸转染所述免疫细胞，所述IMP复合物包含至少一个抑制性信号结构域和一个结合结构域，所述结合结构域与使得所述抑制性结构域移位的可溶性化合物接触；(c)选择其中第一和第二多肽在免疫细胞的膜中共表达的免疫细胞。22.根据权利要求21所述的用于生产工程化免疫细胞的方法，其中，所述转染通过使用逆转录病毒载体进行。23.根据权利要求21所述的用于生产工程化免疫细胞的方法，其中，所述转染通过使用编码多顺反子CAR/IMP的mRNA进行。24.根据权利要求21-23中任一项所述的用于生产工程化免疫细胞的方法，进一步包括以下步骤：通过失活至少一种编码T细胞受体(TCR)组分的基因来制备同种异体免疫细胞。25.根据权利要求24所述的用于生产工程化免疫细胞的方法，其中，制备所述同种异体免疫细胞的所述步骤通过使用TALE-核酸酶进行。26.抑制性双重CAR/IMP复合物，包含至少两种跨膜嵌合多肽：-第一种，编码包含一个二聚化结合结构域的嵌合抗原受...

【专利技术属性】
技术研发人员：菲利普·迪沙托，亚历山大·朱耶拉特，劳伦特·普瓦罗，
申请(专利权)人：塞勒克提斯公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR