用于重编程细胞的包含纯化的经修饰的RNA的RNA制剂制造技术

本发明专利技术提供了使用包含编码iPS细胞诱导因子的单链mRNA的纯化的RNA制剂重编程体细胞的组合物和方法。纯化的RNA制剂优选大体上不含RNA污染分子，所述RNA污染分子：i)可激活体细胞的免疫反应，ii)减少体细胞中单链mRNA的表达，和/或iii)激活体细胞中的RNA传感器。在某些实施方案中，纯化的RNA制剂大体上不含部分mRNA、双链RNA、未加帽的RNA分子和/或单链连缀mRNA。

RNA formulations comprising purified, modified RNA for reprogramming cells

The present invention provides compositions and methods of use of single stranded mRNA containing iPS cells induced by encoding factor of purified RNA preparations of cellular reprogramming. The RNA formulation is preferably substantially purified containing RNA molecular contamination, the pollution of RNA molecule: I) immune response can activate cells, II) decreased expression in somatic cells of single stranded mRNA, and / or III) activation of the RNA sensor in a cell. In some embodiments, the RNA molecule purified RNA preparations generally does not contain mRNA, double stranded RNA, non cap and / or single stranded mRNA clusters.

【技术实现步骤摘要】
用于重编程细胞的包含纯化的经修饰的RNA的RNA制剂本申请是申请日为2010年12月7日，申请号为201080063294.2，专利技术名称为“用于重编程细胞的包含纯化的经修饰的RNA的RNA制剂”的专利技术专利的分案申请。本申请要求于2009年12月7日提交的美国临时申请序列No.61/267,312(将其通过引用整体并入本文)的优先权。本申请还要求于2009年3月27日提交的美国申请序列No.11/990,646号(所述申请为于2006年8月21日提交的进入美国国家阶段的PCT/US06/32372，PCT/US06/32372要求于2005年8月23日提交的美国临时申请No.60/710,164的优先权)的优先权，将所有所述申请通过引用整体并入本文。专利
本专利技术涉及通过将细胞与纯化的RNA制剂接触来改变或重编程真核细胞(包括人或其它动物细胞)的分化状态的组合物和方法，所述RNA制剂包含由一种或多种不同的各自编码重编程因子(例如，iPS细胞诱导因子)的单链mRNA分子或由所述单链mRNA分子组成。纯化的单链mRNA分子优选包含至少一个经修饰的核苷(例如，选自假尿苷(缩写为希腊字母“psi”或“Ψ”)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、5-甲基尿苷(m5U)、2′-O-甲基尿苷(Um或m2’-OU)、2-硫尿苷(s2U)和N6-甲基腺苷(m6A))，其替代相应的未修饰的经典核苷的至少一部分(例如，替代大体上所有相应的未修饰的A、C、G或T经典核苷)。此外，单链mRNA分子优选纯化为大体上不含在细胞中激活不期望的反应、减少单链mRNA的表达和/或激活RNA传感器的RNA污染分子。在某些实施方案中，纯化的RNA制剂大体上不含比全长单链mRNA分子短或长的、为双链RNA和/或未加帽的RNA的RNA污染分子。背景2006年，(Takahashi和Yamanaka2006)报导了编码4个蛋白质因子(OCT4(Octamer-4；POU5类同源框1)、SOX2(SRY(性别决定区Y)-box2)、KLF4(Krueppel-样因子4)和c-MYC)的基因至分化小鼠体细胞的转导诱导这类细胞成为多能干细胞(在本文中称为“诱导多能干细胞”、“iPS细胞”或“iPSC”)。在该最早的报导后，多能干细胞还可通过用编码类似的人蛋白质因子(OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC)的基因(Takahashi等，2007)转化人体细胞或通过用编码人OCT4和SOX2因子的基因加上编码两个其它人因子NANOG和LIN28(Lin-28同源物A)的基因转化人体细胞(Yu等，2007)来进行诱导。所有这类方法使用逆转录病毒或慢病毒将编码重编程因子的基因整合入转化的细胞的基因组并且体细胞只在较长的一段时间(例如，超过一周)内被重编程为iPS细胞。从分化的体细胞产生iP细胞大有希望成为通过细胞移植治疗疾病的可能方法。从个体患者的体细胞产生iPS细胞的可能性还可使得能够发展具有更小的因免疫排斥而产生的风险的患者特异性疗法。此外，从疾病特异性体细胞产生iPS细胞有希望成为研究和开发治疗特异性疾病状态的的药物的方法(Ebert等，2009，Lee等，2009，Maehr等，2009)。编码蛋白质重编程因子(或“iPSC因子”)的基因的病毒递送提供了从体细胞产生iPS细胞的高效方法，但外源DNA至基因组内的整合，无论是随机还是非随机的，产生不可预料的结果并且可最终导致癌症(Nakagawa等，2008)。新近报导显示可通过使用不需要基因组整合的其它方法(以更低的效率)产生iPS细胞。例如，包含OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC的基因的表达质粒至小鼠胚胎成纤维细胞的重复转染产生iPS细胞得到证明(Okita等，2008)。诱导的多能干细胞还通过引入表达编码人OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、NANOG和LIN28的基因的质粒由人体细胞产生(Yu等，2009)。用于产生iPS细胞的其它成功方法包括利用：重组蛋白质重编程因子(Zhou等，2009)、非整合腺病毒(Stadtfeld等，2008)或piggyBac转座子(Woltjen等，2009)递送重编程因子来处理体细胞。目前，使用这类非病毒递送技术递送重编程因子来产生iPS细胞几乎是无效的。用于潜在临床应用的产生iPS细胞的其它方法需要增加iPS细胞形成的速度和效率同时维持基因组完整性。专利技术概述本专利技术提供了用于重编程真核细胞(包括人或其它动物细胞)的分化状态的方法，通过将细胞与纯化的RNA制剂(包含一种或多种不同的各自编码重编程因子(例如，iPS细胞诱导因子)的单链mRNA分子或由所述单链mRNA分子组成)接触。纯化的单链mRNA分子优选包含至少一个经修饰的核苷(例如，选自假尿苷(Ψ)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、5-甲基尿苷(m5U)、2′-O-甲基尿苷(Um或m2’-OU)、2-硫尿苷(s2U)和N6-甲基腺苷(m6A))，其替代相应的未修饰的A、C、G或T典型核苷的相应未修饰的典型核苷的至少一部分(例如，包括几乎全部)。此外，优选纯化单链mRNA分子至大体上不含RNA污染分子，所述RNA污染分子可在细胞中激活不期望的反应、减少单链mRNA的表达和/或激活RNA传感器(例如，双链RNA-依赖性酶)。在某些实施方案中，纯化的RNA制剂大体上不含比全长单链mRNA分子短或长的、为双链RNA和/或未加帽的RNA的RNA污染分子。在某些优选实施方案中，本专利技术提供了用于重编程分化的真核细胞(包括人或其它动物体细胞)的组合物和方法，该方法通过将细胞与包含一种或多种不同的各自编码iPS细胞诱导因子的单链mRNA分子或由所述单链mRNA分子组成的纯化的RNA制剂接触来进行。在某些实施方案中，本专利技术提供了用于改变体细胞的分化状态的方法，包括：将编码iPS细胞诱导因子的mRNA引入体细胞以产生重编程去分化的细胞，其中mRNA包含至少一个5-甲基胞苷(或本文中描述的其它经修饰的碱基)。在某些实施方案中，本专利技术提供了用于将展示第一分化状态或表型的细胞重编程成展示第二分化状态或表型的细胞的方法，包括：向展示第一分化状态的细胞引入包含编码至少一种重编程因子的经修饰的mRNA分子的纯化的RNA制剂和在其中细胞展示第二分化状态的条件下培养所述细胞。在某些实施方案中，经修饰的mRNA分子包含至少一种选自假尿苷或5-甲基胞苷的经修饰的核苷。在某些实施方案中，细胞选自人或动物。在其它实施方案中，纯化的RNA制剂：i)包含编码第一iPS细胞诱导因子的第一单链mRNA，其中大体上所有第一单链模板mRNA包含至少一个假尿苷残基和/或至少一个5-甲基胞苷残基，和ii)大体上不含能够激活所述体细胞中的RNA传感器的RNA污染分子。在某些实施方案中，RNA污染分子选自：仅编码一部分所述iPS细胞诱导因子的部分mRNA、比全长mRNA短的RNA分子、比全长mRNA长的RNA分子、双链mRNA分子和未加帽的mRNA分子。在某些实施方案中，本专利技术提供了用于重编程体细胞(例如，去分化或转分化)的方法，包括：将体细胞与纯化的RNA制剂接触以产生重编程细胞，其中纯化的RNA制剂：i)包含编码第一iPS细胞诱导因子的第一单链mRNA，其中大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于将位于体外并展示第一分化状态或表型的人或其它哺乳动物体细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)的方法，包括：a) 将包含体外合成的修饰mRNA分子的纯化的RNA制剂引入所述展示第一分化状态或表型的细胞，所述体外合成的修饰mRNA分子编码iPSC诱导因子OCT4、SOX2、KLF4和MYC，包含未进一步修饰的假尿苷(Ψ)或1‑甲基假尿苷(m

【技术特征摘要】
2009.12.07 US 61/2673121.一种用于将位于体外并展示第一分化状态或表型的人或其它哺乳动物体细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)的方法，包括：a)将包含体外合成的修饰mRNA分子的纯化的RNA制剂引入所述展示第一分化状态或表型的细胞，所述体外合成的修饰mRNA分子编码iPSC诱导因子OCT4、SOX2、KLF4和MYC，包含未进一步修饰的假尿苷(Ψ)或1-甲基假尿苷(m1Ψ)替代至少一部分未修饰的尿苷核苷，并展示5’帽和3’多聚腺苷酸尾；其中构成所述纯化的RNA制剂的所述修饰mRNA分子采用除去RNA污染分子的过程纯化，所述RNA污染分子通过诱导先天性免疫反应而具有免疫原性并对细胞具有毒性，如可通过测量与自用未纯化的修饰mRNA分子转染的树突细胞的INF-α或TNF-α细胞因子分泌比较，自用所述纯化的修饰mRNA分子转染的树突细胞的所述细胞因子分泌降低而检测；使得所述纯化的RNA制剂不含RNA污染分子，所述RNA污染分子如果存在，将在所述细胞中激活足以阻止所述细胞存活和重编程细胞产生的免疫反应；和b)在数天重复所述纯化的RNA制剂的所述引入，并培养细胞，其中细胞重编程为iPSC。2.一种用于将位于体外并展示第一分化状态或表型的人或其它哺乳动物体细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)的方法，包括：a)将包含体外合成的修饰mRNA分子的纯化的RNA制剂引入展示第一分化状态或表型的人或其它哺乳动物体细胞，所述体外合成的修饰mRNA分子：(i)包含至少一种选自1-甲基假尿苷(m1Ψ)的修饰的核苷替代至少一部分对应的未修饰的核苷尿苷，未进一步修饰的假尿苷(Ψ)替代至少一部分对应的未修饰的核苷尿苷，5-甲基尿苷(m5U)替代至少一部分对应的未修饰的核苷尿苷，5-甲氧基尿苷(mo5U)替代至少一部分对应的未修饰的核苷尿苷，2-硫尿苷(s2U)替代至少一部分对应的未修饰的核苷尿苷和5-甲基胞苷(m5C)替代至少一部分对应的未修饰的核苷胞苷；(ii)展示5’帽；(iii)展示3’多聚腺苷酸尾，所述多聚腺苷酸尾包含50-200个或超过150个核苷酸；和iv)编码iPSC诱导因子OCT4、SOX2、KLF4和MYC；其中构成所述纯化的RNA制剂的所述修饰mRNA分子采用除去RNA污染分子的过程纯化，所述RNA污染分子通过诱导先天性免疫反应而具有免疫原性并对细胞具有毒性，如可通过测量与自用未纯化的修饰mRNA分子转染的树突细胞的INF-α或TNF-α细胞因子分泌比较，自用所述纯化的修饰mRNA分子转染的树突细胞的所述细胞因子分泌降低而检测；使得所述纯化的RNA制剂不含RNA污染分子，所述RNA污染分子如果存在，将在所述细胞中激活足以阻止所述细胞存活和重编程细胞产生的免疫反应；和b)在数天重复所述纯化的RNA制剂的所述引入，并培养细胞，其中细胞重编程为iPSC。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述纯化过程包括：a)采用HPLC或重力流动柱纯化，将所述修饰的mRNA分子纯化；和/或b)用核糖核酸酶III(RNA酶III)处理所述修饰的mRNA分子，使得产生短的RNA酶III消化产物，和从所述修饰的mRNA分子中纯化出所述短的RNA酶III消化产物。4.权利要求1或2所述的方法，其中所述RNA污染分子选自dsRNA分子和未加帽的mRNA分子。5.权利要求1或2所述的方法，其中所述纯化的RNA制剂包含体外合成的修饰的mRNA分子：其中(i)大于98%的所述修饰的mRNA分子被加帽；(ii)所述修饰的mRNA分子展示具有帽1结构的帽，其中相对于帽核苷酸的倒数第二个核苷酸的核糖的2’羟基被甲基化；(iii)所述多聚腺苷酸尾包含50-200个或超过150个核苷酸；(iv)所述修饰的mRNA分子展示选自以下的至少一个特定序列：异源5’UTR序列、Kozak序列、IRES序列和3’UTR序列，其中与不展示所述特定序列的相同mRNA分子相比，所述特定序列导致修饰的mRNA分子的更强翻译，包括其中所述5’UTR序列或3’UTR序列来自非洲爪蟾或人α珠蛋白或β珠蛋白mRNA，或其中所述5’UTR序列是来自烟草蚀纹病毒(TEV)RNA的序列；(v)假尿苷(Ψ)或1-甲基假尿苷(m1Ψ)修饰的核苷替代大体上所有相应的未修饰尿苷核苷而存在；(vi)所述体外合成的修饰的mRNA分子还包含替代至少一部分对应的未修饰的胞苷核苷的5-甲基胞苷(m5C)修饰的核苷；和/或(vii)所述修饰的mRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：凯塔林·卡里科，德鲁·韦斯曼，加里·达尔，安东尼·珀森，朱迪思·迈斯，杰罗姆·詹德里萨克，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚州大学信托人，
类型：发明
国别省市：美国,US