抗CEA抗原VHH结构域及含有其的双特异性抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种抗CEA抗原的VHH结构域及单域抗体，以及含有两种VHH结构域的双特异性抗体，所述抗体由两条不同的重链序列融合而成，可以分别识别CEA抗原的不同表位。所述VHH结构域、单域抗体以及双特异性抗体均具有优异的抗体识别能力，显著的ADCC效应、并具有较长的体内半衰期，在体内外诊断和药物制备领域具有广阔的应用前景。

Anti CEA antigen VHH domain and bispecific antibody containing the same

The invention discloses an anti CEA antigen of the VHH domain and single domain antibody, and contains two VHH domains of bispecific antibody, the antibody from two different sequence of heavy chain fused together, can separately identify different epitopes of CEA antigen. The VHH domain and single domain antibody and bispecific antibody antibody has excellent recognition ability, the half-life of significant ADCC effect, and has a long body, and has wide application prospect in vivo diagnosis and drug preparation field.

【技术实现步骤摘要】
抗CEA抗原VHH结构域及含有其的双特异性抗体
本专利技术公开了一种多肽，更具体地，公开了一种抗体，属于免疫学

技术介绍
癌胚抗原(CEA，又称为CEACAM-5或CD66e)是一种具有约180kDa分子量的糖蛋白。CEA是免疫球蛋白超家族的一名成员，并且含有经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与细胞膜连接的7个域。7个域包括单一N端Ig可变域和与Ig恒定域同源的6个域(A1-B1-A2-B2-A3-B3)。CEA最初分类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现在已经在几种正常成年组织中鉴定出。CEA的过量表达在许多类型的癌症中观察到，包括结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞瘤、乳腺癌和甲状腺癌。因此，CEA已经被鉴定为肿瘤相关抗原。CEA容易自细胞表面切割，并直接或经由淋巴系统自肿瘤脱落入血流中。由于此特性，已经使用血清CEA的水平作为临床标志物以诊断癌症并筛选癌症。而且，CEA也已被用作肿瘤标记，测量癌症患者血液中升高的CEA的免疫学测定法已在临床上用于癌症的预后和控制。更重要的是，CEA已成为用于靶向治疗的潜在有用的肿瘤相关抗原。已经报道的使用CEA靶向免疫治疗癌症主要有2种主要方法：一种方法使用抗CEA抗体引发免疫细胞的溶解活性，特别是通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)，以消除表达CEA的肿瘤细胞。另一种方法是通过抗CEA抗体或抗体片段与例如药物、毒素、放射性核苷酸、免疫调节剂或细胞因子等效应分子缀合，特异性靶向表达CEA的肿瘤细胞，从而发挥效应分子的治疗作用。目前已经针对CEA生成多种单克隆抗体。Chester等已经自噬菌体展示文库分离出单链抗CEA抗体以在放射性免疫检测和放射性免疫疗法中使用(美国专利No.5,876,691)，随后将抗体人源化(美国专利No.7,232,888)。放射性标记的抗CEA抗体已经在结肠直肠癌患者的临床试验中使用。1993年，Hamers-Casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一种天然缺失轻链的抗体，即，仅有重链的抗体(heavychain-only-likeAntibody，HCAbs)，由于该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，其抗原结合区仅是一个通过铰链区与Fc区连接的单结构域，因此该类抗体又称为单域抗体。该类抗体不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。VHH结构域的晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa，此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)，单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体或者单域抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。因此，纳米抗体或单域抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。但是，基于单表位识别抗体存在的结构性缺陷也同时制约着该类抗体的进一步应用。这是因为传统的天然抗体虽然是双价抗体，但是两组相同的重链和轻链组合，只能识别和结合相同的抗原表位，这种单价的线性结合不仅会使识别和结合的能力低下，还会因为结合表位的缺失和变异而难以完成识别和结合的目的。双特异性抗体是近几年发展起来的一种抗体技术，可以同时识别2种不同的抗原。利用双特异性抗体，可以研发同时针对同一抗原不同表位的双价抗体。抗体分子是通过其重链和轻链可变区共同组成一个特定的空间结构，识别抗原分子，普通的抗体有四条多肽链组成，2条相同的轻链，2条相同的重链，只能识别同一个抗原分子。双特异性抗体可以利用不同的技术获得，如将2种不同抗体的可变区序列串联在同一个恒定区序列基因上，这样表达出来的抗体分子有2种不同的抗原结合区；或者利用化学的方法，将2个不同轻链、2个不同的重链分子连接成一个抗体样结构的分子。抗体分子的重链和轻链可变区可以形成一定的空间结构，识别特定的抗原分子。有研究发现，不同的抗体分子间，存在轻链序列或者重链序列相同的现象，证明轻链和重链通过空间结构的相互契合，可以识别不同的抗原分子或者识别同一抗原的不同表位，这也是抗体分子交叉反应的理论基础。基于现有技术中传统抗体在识别和结合CEA抗原中存在的技术问题，本专利技术的目的就是提供一种能够特异性识别CEA抗原的VHH结构域，即纳米抗体，含有该结构域的单域抗体，以及能够同时针对CEA抗原不同表位的双特异性纳米抗体。
技术实现思路
基于上述目的，本专利技术首先提供了一种抗CEA抗原的VHH结构域，所述VHH结构域的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别为SEQIDNO：1的第21-30、45-61、94-99位氨基酸序列所示，或者如SEQIDNO：3的第21-30、45-61、95-110位氨基酸序列所示。在一个优选的技术方案中，所述VHH结构域的序列如SEQIDNO：1或者SEQIDNO：3所示的氨基酸序列所示；在本专利技术中纳米抗体11C12即具有如SEQIDNO：1所示氨基酸序列的VHH结构域，纳米抗体2C2即具有如SEQIDNO：3所示氨基酸序列的VHH结构域。其次，本专利技术还提供了一种含有上述VHH结构域的单域抗体，所述抗体的恒定区序列如SEQIDNO：5所示；所述单域抗体即带有缺失CH1的恒定区序列的VHH结构域序列。第三，本专利技术提供了一种双特异性抗体，所述抗体含有两条序列不同的重链，所述两条序列不同的重链由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列与SEQIDNO：3所示的氨基酸序列串联而成。优选地，由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列位于所述串联的氨基端。优选地，所述串联的两条序列不同的重链可变区之间设有连接肽，所述连接肽为(G4S)n，其中，n为1-6之间的整数。更为优选地，所述n＝3。再为优选地，所述抗体的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示。尤为优选地，在所述串联的两条序列的羧基端还带有如SEQIDNO：5所示的氨基酸序列恒定区，。第四，本专利技术还提供了一种编码上述抗体序列的核苷酸序列，所述编码序列由SEQIDNO：7所示。第五，本专利技术提供了一种含有上述的核苷酸编码序列的表达载体。优选地，所述载体为pMES4。第六，本专利技术还提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。优选地，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。最后，本专利技术提供了前述的任一抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。本专利技术提供的VHH结构域、单域抗体以及双特异性抗体均具有优异的抗体识别能力，显著的ADCC效应、并具有较长的体内半衰期，在体内外诊断和药物制备领域具有广阔的应用前景。附图说明图1.pMES4表达载体结构示意图；图2.提取的总RNA电泳鉴定图；图3.第一轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；图4.第二轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；图5.pMES4载体双酶切反应产物电泳鉴定图；图6.菌落PCR鉴定转化子电泳鉴定图；图7.纳米抗体SDS-PAGE鉴定图；图8.纳米抗体纯化SDS-PAGE鉴定图；图9.融合表达载体pCDNA3.1(+)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗CEA抗原的VHH结构域，其特征在于，所述VHH结构域的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别为SEQ ID NO：1的第21‑30、45‑61、94‑99位氨基酸序列所示，或者如SEQ ID NO：3的第21‑30、45‑61、95‑110位氨基酸序列所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗CEA抗原的VHH结构域，其特征在于，所述VHH结构域的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别为SEQIDNO：1的第21-30、45-61、94-99位氨基酸序列所示，或者如SEQIDNO：3的第21-30、45-61、95-110位氨基酸序列所示。2.根据权利要求1所述的VHH结构域，其特征在于，所述VHH结构域的序列如SEQIDNO：1或者SEQIDNO：3所示的氨基酸序列所示。3.一种含有权利要求1或2所述VHH结构域的单域抗体，其特征在于，所述抗体的恒定区序列如SEQIDNO：5所示。4.一种双特异性抗体，其特征在于，所述抗体含有两条序列不同的重链，所述两条序列不同的重链由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列与SEQIDNO：3所示的氨基酸序列串联而成。5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于，由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列位于所述串联的氨基端。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋海鹏，于建立，刘原源，李飞，王欢，黄琪，古一，周宇航，李婧婵，
申请(专利权)人：深圳市国创纳米抗体技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44