苯并咪唑类药物半抗原及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种苯并咪唑类药物半抗原及其制备方法和应用。本发明专利技术提供的苯并咪唑类药物半抗原，结构式如式Ⅰ所示：（Ⅰ）。基于苯并咪唑类药物半抗原建立的快速检测试剂盒产品，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适于进行动物源性食品中苯并咪唑类药物残留的现场监控和大量样本的快速筛查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种苯并咪唑类药物半抗原及其制备方法和应用。
技术介绍
苯并咪唑类药物（Benzimidazoles，BMZs）具有广泛的生物活性，对于动物体内各种寄生线虫、绦虫具有很强的驱杀作用，目前在兽医临床上应用广泛。常用的苯并咪唑类药物包括阿苯达唑、奥芬达唑、芬苯达唑、氟苯咪唑、甲苯咪唑、噻苯咪唑和丙氧苯咪唑。但由于苯并咪唑类药物在实验动物显示致畸和致突变作用，且在人体内转化的代谢产物亦有毒理作用，是食品残留中重要的监控对象。中国、美国、欧盟、日本等国家或地区将苯并咪唑类药物列入限制使用的药物和动物源性食品残留检测的监控对象，并制订了各种苯并咪唑类药物（包括其某些代谢物）在不同动物体内（包括肌肉、组织等）的最大残留限量（MRLs），在不同的动物和不同的组织中最大残留限量从10μg/kg到5mg/kg不等，大多数限量是100μg/kg。目前对于动物组织中苯并咪唑类药物的分析方法较多，动物组织和饲料中苯并咪唑类药物的主要检测方法有气相色谱-质谱法（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）、酶联免疫吸附法（ELISA）及高效毛细管电泳法（HPCE）等。气-质联用法需要衍生化后测定，液-质联用仪设备较昂贵，反相高效液相色谱法则作为主要的分析技术，然而理化方法存在复杂、繁琐、需要专业技术人员和专业技能、检测成本高等问题，不能实现大批量样品的快速检测分析；酶联免疫吸附法（ELISA）以其灵敏度高、特异性好、操作简便、成本低等优点适合于大量样品的快速筛选。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种苯并咪唑类药物半抗原及其制备方法。本专利技术提供的苯并咪唑类药物半抗原分子结构式如式Ⅰ所示：式Ⅰ。本专利技术提供的苯并咪唑类药物半抗原的制备方法，包括如下步骤：取阿苯达唑0.5g，加甲醇100ml搅拌，加KOH 0.2g搅拌，60℃加热反应3h。TLC检测，原料基本消失，反应完成。停止反应，冷却到室温，旋蒸除去甲醇，加水溶解，抽滤，除去浑浊，滤液加稀盐酸调节pH值到5，有大量白色沉淀析出，抽滤，加乙醇洗涤，抽滤，得到白色固体，真空干燥，得到半抗原产物。本专利技术的另一个目的是上述苯并咪唑类药物半抗原在免疫检测中的应用，具体包括由所述苯并咪唑类药物半抗原与载体蛋白偶联得到的苯并咪唑类药物抗原，及由所得苯并咪唑类药物抗原免疫动物制备得到的苯并咪唑类药物抗体，所述抗体为苯并咪唑类药物单克隆抗体。其中所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、甲状腺蛋白、卵清白蛋白、人血清蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。本专利技术还提供由上述苯并咪唑类药物半抗原或苯并咪唑类药物抗原在检测苯并咪唑类药物或制备检测苯并咪唑类药物的产品中的应用，具体涉及制备的酶联免疫试剂盒在检测动物源性食品中苯并咪唑类药物残留的应用，苯并咪唑类药物包括氟苯咪唑、丙氧咪唑、甲苯咪唑、阿苯达唑、奥芬达唑、丙硫咪唑亚砜。本专利技术提供的苯并咪唑类药物半抗原、苯并咪唑类药物抗原合成方法简单，通过免疫动物产生了针对苯并咪唑类药物的特异性抗体，抗体的效价、特异性都比较好；用所得的抗体制备酶联免疫试剂盒，检测成本低，使用方便，检测方法准确、快速、可同时检测大批量的样本，适于动物源性食品中苯并咪唑类药物残留的现场监控和大量样本的筛查。本专利技术的苯并咪唑类药物半抗原在苯并咪唑类药物的检测中发挥重要作用。附图说明图1：苯并咪唑类药物半抗原合成路线图图2：苯并咪唑类药物半抗原核磁共振图图3：苯并咪唑类药物ELISA标准曲线具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。下述实施例中所使用的实验方法、材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规方法和常规材料。实施例1：苯并咪唑类药物半抗原的合成和鉴定（合成路线如图1）取阿苯达唑0.5g，加甲醇100ml搅拌，加KOH 0.2g搅拌，60℃加热反应3h。TLC检测，原料基本消失，反应完成。停止反应，冷却到室温，旋蒸除去甲醇，加水溶解，抽滤，除去浑浊，滤液加稀盐酸调节pH值到5，有大量白色沉淀析出，抽滤，加乙醇洗涤，抽滤，得到白色固体，真空干燥，得到半抗原产物。上述苯并咪唑类药物半抗原分子结构式如式Ⅰ所示：式Ⅰ。取上述产物用核磁共振确定结构，如图2所示， 1HNMR鉴定，1HNMR（DMSO,300M）;δ0.9（t, J=7.2Hz,3H CH3）; δ1.35（q, J=7.2Hz 2H CH2）;δ2.94（d, J=7.2Hz,2H SCH2）; δ7.18（d, J=7.42Hz 1H CH）;δ7.49（d, J=7.42Hz 1H CH）; δ7.62（s, 1H CH）; δ5.0（s, 1H NH）; δ9.15（s, 1H NH）; δ11.0（s, 1H OH）。实施例2：苯并咪唑类药物抗原的制备将苯并咪唑类药物半抗原与载体蛋白偶联得到苯并咪唑类药物抗原，分子结构式如式Ⅱ所示： 式Ⅱ。一、免疫原制备取12.3mg苯并咪唑类药物半抗原用1ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解，取15mg碳化二亚胺（EDC）用0.2ml水充分溶解后加入上述溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A。称取牛血清白蛋白（BSA）40mg，使之充分溶解在3ml 水中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h。用0.01mol/L的PBS溶液在4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20℃保存备用。二、包被原制备取15.5mg苯并咪唑类药物半抗原用1.5ml DMF溶解冷却至10℃得到溶液B，取氯甲酸异丁酯10μl加入溶液B中，10℃搅拌反应30min得到溶液C；取25mg卵清蛋白（OVA）用2.2ml 50mmol/L Na2CO3溶解，和上述溶液C在10℃反应4h，然后4℃过夜；用0.01mol/L的PBS溶液在4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20℃保存备用。实施例3：苯并咪唑类药物单克隆抗体的制备动物免疫：将实施例2中得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生多克隆抗体。细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1比例与SP2/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苯并咪唑类药物半抗原，其特征在于分子结构式如式Ⅰ所示：式Ⅰ。

【技术特征摘要】
1.一种苯并咪唑类药物半抗原，其特征在于分子结构式如式Ⅰ所示：
式Ⅰ。
2.一种如权利要求1所述的苯并咪唑类药物半抗原的制备方法，其特征在
于包括如下步骤：
取阿苯达唑0.5g，加甲醇100ml搅拌，加KOH 0.2g搅拌，60℃加热反
应3h。TLC检测，原料基本消失，反应完成。停止反应，冷却到室温，
旋蒸除去甲醇，加水溶解，抽滤，除去浑浊，滤液加稀盐酸调节pH值
到5，有大量白色沉淀析出，抽滤，加乙醇洗涤，抽滤，得到白色固体
，真空干燥，得到半抗原产物。
3.一种苯并咪唑类药物抗原，其特征在于由权利要求1所述的苯并咪唑类
药物半抗原与载体蛋白偶联得到，分子结构式如式Ⅱ所示： 
式Ⅱ。
4.一种如权利要求3所述的苯并咪唑类药物抗原的制备方法，其特征在于
包括如下步骤：
取12.3mg苯并咪唑类药物半抗原用1ml DMF溶解，取15mg EDC用0.2
ml水充分溶解后加入上述溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A
。称取BSA 40mg，使之充分溶解在3ml 水中，将反应液A逐滴缓慢滴
加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h。用0.01mol/L的PBS溶液在4℃

【专利技术属性】
技术研发人员：冯才伟，罗晓琴，常平平，陶光灿，刘春雪，李海静，马腊腊，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11