本发明专利技术公开了一种抗CD16抗原的纳米抗体，以及含有两种VHH结构域的双特异性抗体。所述抗CD16抗原的纳米抗体具有独特的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3。所述双特异性抗体由两条不同的重链序列融合而成，可以分别识别NK细胞表面的CD16抗原和CA125抗原。且该双特异性抗体能够显著增强抗体介导的NK细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性。胞的活性。胞的活性。
【技术实现步骤摘要】
一种抗CD16和CA125抗原的双特异性抗体
[0001]本专利技术公开了一种多肽，更具体地，公开了一种抗体，属于免疫学领域。
技术介绍
[0002]CA125 （Cancer Antigen 125）卵巢癌相关抗原发现于1981年，是卵巢上皮性类癌的相关性抗原。由胚胎期上皮细胞分泌，正常情况下不分泌或极少分泌，但是当卵巢发生恶性病变时，即使临床上没有表现或病理上难以识别时，CA125值也会升高，因而是较好的卵巢癌诊断及筛查指标，并与卵巢癌的转移及预后有密切关系。CA125最初是由Bast等通过卵巢细胞系OVCA433免疫原介导鼠源性单克隆抗体OC125应答，继而识别并确认其存在。CA125抗原为相对分子质量达200 ku的糖蛋白，兼有膜结合型与游离型两种态性，是迄今为止研究最全面的卵巢癌血清标志物之一。90%进展期的卵巢癌患者血清中的CA125浓度都会呈现不同程度的升高。
[0003]尽管卵巢癌患者首选手术或化疗等方法，但其预后仍不十分理想。 肿瘤复发，尤其是腹腔内复发，以及化疗耐药，往往是影响预后的重要因素。目前，卵巢癌新的治疗方案，特别是生物治疗技术发展迅速，且已部分应用于离体和体内研究及临床试验中。卵巢癌生物治疗包括细胞因子、单克隆抗体、转基因疗法等多种形式。在诸多途径中，卵巢癌相关抗原CA125单克隆抗体疗法较为引人瞩目。目前CA125单克隆抗体治疗卵巢癌的技术包括抗原抗体复合物介导人体免疫应答和放射性元素与抗肿瘤药物靶向性诱导两类。抗原抗体复合物介导免疫是依靠激发机体内源性抗肿瘤反应，达到清除病灶、自我修复调控的目的。应用于该技术中最具代表性的抗体为抗CA125/抗T细胞表面分子双特异性抗体 （BsAb）和鼠源性单克隆抗体B43.13。抗CA125/抗 T细胞表面分子双特异性抗体通过与卵巢癌细胞表面CA125抗原结合，继而以抗T细胞表面分子表位识别诱导T细胞，产生T细胞针对肿瘤组织的细胞毒作用，将病灶杀灭。除此之外，该疗法还能激发机体自身产生和维持较长时间的主动免疫状态。目前抗CA125/抗T细胞表面分子BsAb虽然表现出优异的治疗效果，但是仍有较多问题亟待解决，比如详细的体内药物代谢动力学特征尚不明确；制备工艺人源化水平较低且毒副反应较明显；BsAb、肿瘤及T淋巴细胞的特异性和亲和力方面均需进一步提高；抗体Fc片段功能仍需改良；抗体肿瘤组织渗透性不高，由此带来了体内肿瘤定位不强、非目的清除率较高的技术问题。鼠源性单克隆抗体B43.13则通过结合CA125抗原形成免疫复合物，启动经典的独特型免疫应答，其作用机制为人源的抗鼠抗体激活抗独特型链式反应，进而引起针对CA125的多克隆抗体体液免疫应答。此免疫应答疗法耐受性好，无不良反应或非依从等暂停用药情况，但无法始终保持人体对肿瘤细胞的敏感应答状态，亦不能克服肿瘤免疫逃逸机制。放射性元素与抗肿瘤药物靶向性诱导技术是另外一种CA125单克隆抗体治疗技术。卵巢癌肿瘤细胞减灭术后，残留癌细胞仍在腹腔内种植。一般情形下，这类种植细胞或细胞簇临床不易发现，化疗耐药率高，但其在放射免疫破坏下却相当脆弱。基于该特点，卵巢癌放射免疫疗法发展迅猛。目前的放射免疫疗法主要选择含抗CA125表位的鼠源性单克隆抗体，同位素标记后，靶向定位及放疗。多项试验证实，放射元素标记后，CA125单克隆抗
体与其抗原的亲和性并不减弱。然而，传统的单克隆抗体直接放射标记法缺陷较多，尤其是网状内皮系统中放射毒性蓄积及实体瘤疗效欠佳。网状内皮系统蓄积，极大地削弱了同位素标记抗体靶向定位率。至于实体瘤放射免疫疗效欠佳，一般归咎为肿瘤组织摄取浓度低于最适放疗浓度，血浆清除率低及骨髓毒性等。
[0004]基于CA125在临床诊断方面所表现出的突出特性以及在肿瘤治疗领域的巨大应用前景，研发出针对CA125的特异性结合抗体，改善临床诊断和治疗效率成为现有技术的迫切需求。但是基于传统抗体的一些缺点，例如亲和力不高，免疫识别效率低下，对于一些隐蔽程度较高的抗原难以达到理想的结合和中和效果。双特异性抗体是近几年发展起来的一种抗体技术，可以同时识别2种不同的抗原。自然杀伤细胞（natural killer，NK cells）是机体具有细胞毒性的免疫细胞之一，表达CD56和CD16，在肿瘤的免疫治疗中发挥抗肿瘤效应。NK细胞可以在未致敏的情况下，具有很强的杀伤肿瘤细胞和病毒感染性细胞的活性。一个NK细胞可以裂解体积超过其几倍的肿瘤细胞。最近的研究表明，与活化的T淋巴细胞不同，NK细胞更倾向于杀伤肿瘤干细胞[Ames E，Canter RJ，Grossenbacher SK，et al. NK cells preferentially target tumor cells with a cancer stem cell phenotype. The Journal ofImmunology，2015,195(8):4010
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4019]。NK细胞在肿瘤的免疫治疗中发挥抗肿瘤效应的重要机制之一就是ADCC作用。而CD16分子就是NK细胞启动ADCC效应过程中不可或缺的条件，在许多基于抗CD16抗体的肿瘤治疗中，由于只能特异性连接一个抗原靶点，其特异性相对较低，易产生脱靶效应。利用双特异性抗体，可以研发同时针对肿瘤细胞和NK细胞的双特异性抗体，在识别肿瘤细胞抗原，诱导ADCC效应的同时，识别效应NK细胞，将NK细胞引导到肿瘤细胞的附近，加强效应NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，如CA125抗原和NK细胞的CD16抗原。
[0005]纳米抗体是一类仅有重链二聚体（H2）的抗体，分子量只有15kDa，大约10纳米的直径，其主要是IgG2和IgG3类型，此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(Heavy chain only like Antibody，HCAbs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体（sdAb）。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病（重链病）的病理形式被人们所认识，其可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，因此形成一种重链二聚体。相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3
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D结构测定的容易性方面超越scFv。纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。
[0006]基于在肿瘤治疗领域现有技本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种抗NK细胞表面抗原CD16的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQ ID NO.1所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.2所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.3所述氨基酸序列组成。2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区序列由SEQ ID NO.4所述氨基酸序列组成。3.一种编码权利要求2所述纳米抗体序列的核酸，其特征在于，所述核酸的序列由SEQ ID NO.5所示。4.一种含有权利要求3所述的核酸的表达载体，其特征在于，所述载体为pMES4。5.一种含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。6.一种双特异性抗体，其特征在于，所述抗体含有第一重链和第二重链，所述第一重链的可变区识别CD16抗原，其可变区序列由SEQ ID NO.4所述氨基酸序列组成；所述第二重链的可变区识别CA125抗原，其可变区序列由SEQ ID NO.6所述氨基酸序列组成。7.根据权利要求6所述的双特异性抗体，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋海鹏，刘原源，于建立，曹慧，古一，李飞，王准，张霞，蒋立仲，宋亮，
申请(专利权)人：深圳市国创纳米抗体技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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