一种抗CA125的纳米抗体5D2及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗CA125的纳米抗体，所述纳米抗体具有独特的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，本发明专利技术还提供了含有该纳米抗体可变区编码序列的表达载体，以及含有该表达载体的宿主细胞，以及所述纳米抗体在检测血清中CA125含量中的应用。本发明专利技术提供的纳米抗体对CA125具有特异的识别和结合能力，该纳米抗体亲和力可达到3.051E

【技术实现步骤摘要】
一种抗CA125的纳米抗体5D2及其应用


[0001]本专利技术公开了一种纳米抗体，属于免疫学领域。

技术介绍

[0002]CA125(cancer antigen 125)卵巢癌相关抗原发现于1981年，是卵巢上皮性类癌的相关性抗原。由胚胎期上皮细胞分泌，正常情况下不分泌或极少分泌，但是当卵巢发生恶性病变时，即使临床上没有表现或病理上难以识别时，CA125值也会升高，因而是较好的卵巢癌诊断及筛查指标，并与卵巢癌的转移及预后有密切关系。CA125最初是由Bast等通过卵巢细胞系OVCA433免疫原，介导鼠源性单克隆抗体OC125应答，继而识别并确认其存在。CA125抗原为相对分子质量达200ku的糖蛋白，兼有膜结合型与游离型两种态性，是迄今为止研究最全面的卵巢癌血清标志物之一。90％进展期的卵巢癌患者血清中的CA125浓度都会呈现不同程度的升高。
[0003]尽管卵巢癌患者首选手术或化疗等治疗方法，但其预后的效果并不理想。肿瘤复发，尤其是腹腔内复发以及化疗耐药，往往是影响预后的重要因素。目前，卵巢癌新的治疗方案，特别是生物治疗技术发展迅速，且已部分应用于离体和体内研究及临床试验中。卵巢癌生物治疗包括细胞因子、单克隆抗体、转基因疗法等多种形式。在诸多途径中，CA125单克隆抗体疗法尤其引人瞩目。目前CA125单克隆抗体治疗卵巢癌的技术包括抗原抗体复合物介导人体免疫应答和放射性元素与抗肿瘤药物靶向性诱导两类。不仅如此，在卵巢癌的良恶性判断、分期等方面，CA125更是展现了其突出的特性。He等研究发现检测血清CA125诊断卵巢癌良恶性的准确率为88％，灵敏性92％，特异性80％，故认为血清CA125是鉴别卵巢癌良恶性的主要标记物(Journal of Obstetrics and Gynaecology Canada,2012,34:567
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574)。Nakamura等研究发现血清CA125水平与卵巢癌的分期、淋巴结转移、病理类型密切相关，并且在同期卵巢癌患者中，血清CA125水平高者的生存率显著低于CA125水平低者(Acta Medica Okayama.2012,66:53
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60)。
[0004]基于CA125在临床诊断方面所表现出的突出特性以及巨大应用前景，研发出针对CA125的特异性结合抗体，改善临床诊断效率成为现有技术的迫切需求。但是基于传统抗体的一些缺点，例如亲和力不高，免疫识别效率低下，对于一些隐蔽程度较高的抗原难以达到理想的结合效果。
[0005]1993年，Hamers
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Casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一类仅有重链二聚体(H2)的抗体，其主要是IgG2和IgG3类型，此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(Heavy chain only like Antibody，HCAbs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kDa，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(Nbs)。另外，在鲨鱼中也观察到这类单结构域抗体，称为VNAR。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病(重链病)的病理形式被人们所认识。这种仅有重链的抗体可能是由于基因组水平的突变和
缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，因此形成一种重链二聚体。
[0006]相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3
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D结构测定的容易性方面超越scFv。
[0007]纳米抗体因来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为多肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值及发展前景。
[0008]鉴于CA125分子量较大，且糖基化位点较多，常规抗体与之结合难以充分识别一些隐匿于间隙或空腔里的抗原决定簇，如果抗体识别抗原决定簇过于单一或者位点过于接近或者重叠，都会导致特异性的抗原抗体结合反应受到影响，从而严重影响检测效率。因此研发抗CA125的纳米抗体，充分发挥纳米抗体超强的抗原识别能力成为抗体
的一种新的需求。本专利技术的目的就是提供一种能够充分发挥纳米抗体的优越性能，又能克服其固有缺陷的抗CA125的纳米抗体，即所述抗体既具有高度特异的抗原识别能力，具有高度的亲和力，并且具有独特的抗原决定簇识别位点，能够在CA125抗原的免疫检测特别是双抗体夹心法中获得优异的检测效率。

技术实现思路

[0009]基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种抗CA125的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述抗体具有独特的抗原决定簇识别位点。
[0010]在一个优选的技术方案中，所述纳米抗体的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。在本专利技术中具有该可变区序列的纳米抗体的一个优选实施例的纳米抗体被命名为“5D2”。
[0011]其次，本专利技术提供了一种含有上述纳米抗体可变区的抗体，所述抗体还具有恒定区，所述抗体恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
[0012]第三，本专利技术还提供了一种编码上述纳米抗体的核酸，所述核酸的序列如SEQ ID NO.5所示。
[0013]第四，本专利技术提供了一种含有上述核酸的表达载体。
[0014]在一个优选的技术方案中，所述表达载体为pMES4。
[0015]第五，本专利技术提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。在一个优选的技术方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0016]最后，本专利技术还提供了上述纳米抗体在制备免疫法检测CA125试剂盒中的应用。
[0017]在一个优选的技术方案中，所述免疫法为双抗夹心免疫法，上述纳米抗体连接有抗体恒定区，并作为捕获一抗使用。第二抗体的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，在
本专利技术中具有该可变区序列的纳米抗体的一个优选实施例的纳米抗体被命名为“2H7”。
[0018]本专利技术提供的纳米抗体5D2对CA125抗原具有特异的识别和结合能力，该纳米抗体亲和力可达到3.051E
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10，且具有独特的抗原决定簇识别位点，因此，显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗CA125的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.一种含有权利要求2所述纳米抗体的可变区的抗体，其特征在于，所述抗体还具有恒定区，所述抗体的恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。4.一种编码权利要求2所述纳米抗体序列的核酸，...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋海鹏，刘原源，于建立，王准，曹慧，古一，李飞，
申请(专利权)人：深圳市国创纳米抗体技术有限公司，
类型：发明
国别省市：