一种抗CD3和CEA抗原的双特异性抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种抗CD3抗原的纳米抗体，所述抗CD3抗原的纳米抗体具有独特的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3。本发明专利技术还公开了一种含有抗CD3的VHH结构域和抗CEA的VHH结构域的双特异性抗体，所述双特异性抗体由两条不同的重链序列融合而成，可以分别识别T细胞表面的CD3抗原和癌胚抗原CEA，且该双特异性抗体能够显著增强抗体介导的T细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性。性。性。

【技术实现步骤摘要】
一种抗CD3和CEA抗原的双特异性抗体


[0001]本专利技术公开了一种多肽，更具体地，公开了一种抗体，属于免疫学领域。

技术介绍

[0002]癌胚抗原(CEA，又称为CEACAM
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5或CD66e)是一种具有约180kDa 分子量的糖蛋白。CEA是免疫球蛋白超家族的一名成员，并且含有经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与细胞膜连接的7个域。7个域包括单一N端 Ig可变域和与Ig恒定域同源的6个域(A1
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B1
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A2
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B2
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A3
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B3)。CEA最初分类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现在已经在几种正常成年组织中鉴定出。CEA的过量表达在许多类型的癌症中观察到，包括结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞瘤、乳腺癌和甲状腺癌。因此，CEA已经被鉴定为肿瘤相关抗原。CEA容易自细胞表面切割，并直接或经由淋巴系统自肿瘤脱落入血流中。由于此特性，已经使用血清CEA的水平作为临床标志物以诊断癌症并筛选癌症。而且，CEA也已被用作肿瘤标记，测量癌症患者血液中升高的CEA的免疫学测定法已在临床上用于癌症的预后和控制。
[0003]更重要的是，CEA已成为用于靶向治疗的潜在有用的肿瘤相关抗原。已经报道的使用CEA靶向免疫治疗癌症主要有2种主要方法。一种方法使用抗CEA抗体引发免疫细胞的溶解活性，特别是通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)，以消除表达CEA的肿瘤细胞。另一种方法是通过抗CEA抗体或抗体片段与药物、毒素、放射性核苷酸、免疫调节剂或细胞因子等效应分子缀合，特异性靶向表达CEA 的肿瘤细胞，从而发挥效应分子的治疗作用。我们都知道，激活的效应T 细胞可以直接杀伤肿瘤细胞，也可以通过分泌细胞因子诱导肿瘤细胞及其他基质细胞凋亡或者趋化巨噬细胞等实现非特异性免疫杀伤。另一方面，癌细胞也存在免疫逃避机制，逃避免疫系统的杀伤，从而有利于癌细胞的生长与转移，其中免疫抑制性细胞和分子如调节性T细胞 (Regulatory cells，简称Tregs)、髓源性抑制细胞(Myeloid derivedsuppressor cells，简称MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞和白细胞介素
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6 (Interleukin
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6，简称IL
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6)等在这个过程中起到重要作用。因此，促进抗原呈递细胞(Antigen presenting cells，简称APCs)的抗原呈递功能、T 细胞的抗肿瘤效应以及抑制肿瘤相关的免疫抑制因素是免疫治疗的主要策略。
[0004]双特异性抗体是近几年发展起来的一种抗体技术，可以同时识别2 种不同的抗原。利用双特异性抗体，可以研发同时针对肿瘤细胞和T细胞的双特异性抗体，在识别肿瘤细胞抗原，诱导ADCC效应的同时，识别效应T细胞，将T细胞引导到肿瘤细胞的附近，加强效应T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，如CEA抗原和T细胞的CD3抗原。
[0005]1993年，Hamers
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Casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一类仅有重链二聚体(H2)的抗体，其主要是IgG2和IgG3类型，此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(Heavy chain only like Antibody，HCAbs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kDa，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(Nbs)。另外，在鲨鱼中也观察到这类
单结构域抗体，称为VNAR。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病(重链病) 的病理形式被人们所认识。这种仅有重链的抗体可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏 CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，因此形成一种重链二聚体。
[0006]相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3
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D结构测定的容易性方面超越scFv。
[0007]纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。
[0008]基于在肿瘤治疗领域现有技术中的单一识别位点或者传统抗体分子较大难以到达作用细胞等问题，本专利技术的目的就是提供一种同时针对肿瘤细胞和T细胞的双特异性纳米抗体，在识别癌细胞的CEA抗原，诱导 ADCC效应的同时，识别效应T细胞的CD3抗原，将T细胞引导到肿瘤细胞的附近，加强效应T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。且可以克服传统抗体实体肿瘤渗透性差，靶向效应低等固有缺陷。

技术实现思路

[0009]基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种抗T细胞表面抗原CD3 的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、 CDR3，其中，CDR1的序列由SEQ ID NO.1所示，CDR2的序列由SEQID NO.2所示，CDR3的序列由SEQ ID NO.3所示。
[0010]在一个优选的技术方案中，所述纳米抗体的可变区序列由SEQ IDNO.4所示。在本专利技术中具有该可变区序列的纳米抗体的一个优选实施例为纳米抗体9H9。
[0011]其次，本专利技术还提供了一种编码上述纳米抗体的核酸，所述核酸的序列由SEQ ID NO.5所示。
[0012]第三，本专利技术提供了一种含有上述核酸的表达载体，所述表达载体为pMES4。
[0013]第四，本专利技术提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0014]第五，本专利技术还提供了一种双特异性纳米抗体，所述双特异性抗体含有第一重链和第二重链，所述第一重链的可变区识别CD3抗原，其可变区序列由SEQ ID NO.4所示；所述第二重链的可变区识别CEA抗原，其可变区序列由SEQ ID NO.6所示。
[0015]在一个优选的技术方案中，所述第一重链和第二重链之间设有连接肽，所述连接肽为n个(G4S)串联而成，表示为(G4S)
n
，其中n为 1
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6之间的整数。
[0016]更为优选地，所述n＝4，所述双特异性抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。
[0017]第六，本专利技术还提供了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗T细胞表面抗原CD3的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1的序列由SEQ ID NO.1所示，CDR2的序列由SEQ ID NO.2所示，CDR3的序列由SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区的序列由SEQ ID NO.4所示。3.一种编码权利要求2所述纳米抗体的核酸，其特征在于，所述核酸的序列由SEQ ID NO.5所示。4.一种含有权利要求3所述核酸的表达载体，其特征在于，所述载体为pMES4。5.一种含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。6.一种双特异性抗体，其特征在于，所述抗体含有第一重链和第二重链，所述第一重链为权利要求2所述纳米抗体的可变区；所述第二重链的可变区识别CEA抗原，其可变区的序列由SEQ ID NO.6所示。7.根据权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一重链和第二重链之间设有连接肽，所述连...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋海鹏，刘原源，于建立，王准，曹慧，古一，李飞，张霞，蒋立仲，宋亮，
申请(专利权)人：深圳市国创纳米抗体技术有限公司，
类型：发明
国别省市：