全人源抗人CD40单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程，具体涉及一种全人源抗人CD40单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区分别为：B52：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，或B56：SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，或D20：SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，或D24：SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，或D45：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示氨基酸或与其具有至少80％序列同一性的同源序列，所述全人源抗人CD40单抗能特异性地与人CD40结合。本发明专利技术的全人源抗人CD40单克隆抗体具有高生物学激动剂活性的全人源抗CD40特异性单克隆抗体。所述抗体针对CD40阳性肿瘤细胞直接发挥作用，还能够通过调节适应性和固有免疫系统增强机体对肿瘤细胞应答。瘤细胞应答。瘤细胞应答。

【技术实现步骤摘要】
全人源抗人CD40单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程，具体涉及具有高生物学激动剂活性的全人源抗CD40特异性单克隆抗体及其应用。

技术介绍

[0002]近年来，治疗性抗体显示出越来越广阔的应用前景。但由于人抗鼠抗体(human anti
‑
mouse antibody,HAMA)的产生使其应用受到很大限制。抗体库技术的出现为这一问题的解决提供了一条新的途径，为各种不同免疫原包括自身抗原的抗体获得提供了一条有效途径。抗体库技术是20世纪90年代抗体工程领域的重大进展，它的出现得益于三大技术的发展，即PCR扩增技术、大肠杆菌表达系统的优化及噬菌体展示技术，尤其是噬菌体展示技术是实现抗体库技术的重要前提。
[0003]噬菌体展示蛋白质工程或分子进化是蛋白质工程中的一个富有潜力的崭新领域，该技术的显著优点一是表达的融合蛋白或肽类直接与编码它们的基因相关联，将活的噬菌体繁殖扩增即可鉴定和分析结合肽或蛋白的序列，其二，噬菌体展示肽或蛋白的结构和功能常常与天然肽或蛋白具有一样或极为相似的结构和功能，这一技术已成为基础研究和药物筛选的重要手段。噬菌体抗体库技术避免了传统的从杂交瘤细胞中筛选鼠源单抗，再进行人源化改造的繁琐过程，可在较短时间内，得到完全的人源抗体片段，而且无需经过免疫即可得到大量的针对各种抗原的特异性抗体，使人源性抗体制备技术获得突破性的进展。
[0004]全合成人源噬菌体抗体库的设计，需要选择具有代表性的骨架序列以及制定覆盖范围广的CDR序列。抗体库技术的发展和对抗体结构功能认识的深化使人们具备了完全人工设计抗体可变区的能力。随着人类抗体胚系(germline)基因测序完成，人们对抗体结构的认识更深入了一步，使得对人抗体基因的操作更加简单易行。对抗体胚系基因使用频率分析表明，胚系基因的使用具有较强的偏向性，许多胚系基因从不或很少使用(Tomlinson,1995)，这一特点是构建抗体库的重要基础。为保证骨架区的代表性和保守性，骨架区的选择和设计通常采用人抗体胚系基因作为基础骨架。选用多个骨架序列构建多骨架库能够更全面地涵盖人抗体库基因。CDR区序列的设计是合成抗体库的关键，这使合成抗体库具有可控性强的优点，可根据需要人为设计改造抗体的基因。合成抗体库的组分清楚，能够在一定程度上改善抗体多样性的可控性，抗体库的内容、位点变异性、库的整体多样性均可根据设计加以控制调节。
[0005]人为地控制骨架序列和CDR区的设计与合成，可使抗体库的构成和多样性明确化。早期抗体库构建筛选的成功证实了通过全合成技术构建抗体库的可行性，并且为近年来新型合成抗体库的构建积累了丰富的经验。
[0006]CD40是肿瘤坏死因子受体超家族成员5，属于I型跨膜糖蛋白，由277个氨基酸组成，其中膜外区、跨膜区、膜内区分别由193、22和62个氨基酸组成。CD40主要表达在B细胞、胸腺上皮细胞、活化的单核/巨噬细胞、树突状细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞。几乎表达于所有的B细胞恶性肿瘤和多数实体瘤。
ID NO:1。所述抗体是IgG1或IgG2或IgG4形式的抗体或抗原结合片段。其抗原结合片段是选自以下的抗体片段：Fab、scFv或(Fab
’
)2片段。
[0019]本专利技术的全人源抗人CD40单克隆抗体至少具有如下几种应用方式：一种单链抗体，其含有本专利技术全人源抗人CD40单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区。
[0020]一种核酸分子，其编码本专利技术所述全人源抗人CD40单克隆抗体分子或单链抗体或抗原结合片段的轻链或重链。
[0021]一种表达载体或载体组，其含有本专利技术全人源抗人CD40单克隆抗体的核酸分子。
[0022]一种宿主细胞，其含有或表达本专利技术所述的全人源抗人CD40单克隆抗体的载体或载体组。所述宿主细胞是原核的或真核的，选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。
[0023]一种药物或药物组合物，其含有本专利技术的全人源抗人CD40单克隆抗体或单链抗体或其抗原结合片段。所述药物或药物组合用于诊断、治疗或改善与CD40信号相关的疾病。所述疾病为癌症、自身免疫性疾病或炎性疾病。
[0024]本专利技术的全合成人源抗体库采用以下设计方案：应用生物信息学方法，通过检索Absys、VBASE2、NCBI、Kabat、Genbank、PDB等数据库，下载人源和鼠源等抗体基因序列，比较分析大量序列之间的同一性和差异性，对抗体骨架序列在人类抗体库中的出现频率进行排序，以保证抗体库的代表性和保守性为原则，选择了优化的VH/VL框架序列，确定了构建抗体库的germline基因，即两种人源IgG型抗体轻链可变区master基因，Vκ2和Vκ3，以及两种人源IgG型抗体重链可变区master基因，VH3和VH4。为了便于文库构建，对抗体骨架序列进行模块化设计，在骨架区和CDR区的边界引入稀有的单一酶切位点，便于CDR区与骨架区的灵活拆卸与组装。对于人源抗体可变区的CDR区域，收集抗体可变区的氨基酸序列(包括所有的人抗体胚系基因和重排序列)，进行序列同源性分析和氨基酸使用频率和偏向性分析。选择CDR区域多样性较高的氨基酸位置，按大肠杆菌密码子使用原则将其转换为核苷酸序列，使用简并密码子进行了长度多样性和序列多样性设计，尽量合理地覆盖所有典型的CDR结构。利用成熟的抗体库构建和噬菌体展示技术，筛选特异性结合人CD40抗原的分子。
[0025]本专利技术所使用的抗体库，是大容量的全合成人源scFv噬菌体抗体库。为了提高和改变获得的抗体分子亲和力，采用了亲和力成熟筛选技术，通过分子进化改进CD40单抗分子的结合能力。
[0026]本专利技术的分子进化技术是通过PCR引入突变的。突变引物设计是这一技术中获得足够数量的有用突变的关键步骤。本专利技术中所述的目标区域(即拟突变的区域)是抗体D45分子的CDR区，优先选择的是轻链和重链的CDR3。
[0027]本专利技术中在分子进化之前或之后通过淘筛获得的抗体分子是scFv形式的。这种形式可以通过本领域的技术人员熟知的基因工程技术方便地进一步转换成Fab、全长抗体或其他形式。
[0028]本专利技术中经亲和力成熟获得的高亲和力抗人CD40单克隆抗体T60，其原型分子D45是用人CD40作为抗原在上述全合成人源抗体库中进行淘筛获得的。通过SPR法分析测定，T60以8.344
×
10
‑9或更小的平衡解离常数KD(M)结合CD40。所述抗体与人CD40的细胞水平亲和力相比D45提高了约5倍，这也是通过ELISA实验的半数有效浓度EC
50
体现的。
[0029]本专利技术公开了5株特异性抗人CD40单抗B52、B56、D20、D24和D45以及分子进化后优
选的1株高亲和力抗人CD40单抗T60的氨基酸序列，包含全人源框架区以及全人源轻链和重链可变区。
[0030]本专利技术中，所述抗体分子的重链和轻链是全人源的，尽管嵌合的或人源化的也可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种全人源抗人CD40单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区分别为：B52：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，或B56：SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，或D20：SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，或D24：SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，或D45：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示氨基酸或与其具有至少80％序列同一性的同源序列，所述全人源抗人CD40单抗能特异性地与人CD40结合。2.根据权利要求1所述的全人源抗人CD40单克隆抗体，其特征在于：是从全合成人源噬菌体抗体库中筛选得到。3.根据权利要求1所述的全人源抗人CD40单克隆抗体，其特征在于：所述以D45的轻重链可变区为母序列，亲和力成熟后得到全人源抗人CD40单克隆抗体T60。4.根据权利要求3所述的全人源抗人CD40单克隆抗体，其特征在于：所述T60包括轻链与重链，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:12所示氨基酸或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；其中X1是R、E、P、K或Q；X2是S、E、G或K；X3是T、R或K，优选K；X4是M、Q、A、N、D、S或E；X5是E、S、D或N；X6是F、K、R或S；X7是L、Y或I；所述重链可变区包含如SEQ ID NO:13所示氨基酸或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；其中X1是D、L、G、V、K、T或S；X2是S、N或M；X3是V、R、P或M；X4是A、S、T、N、R或D，优选R；X5是S、P或N；X6是F、R、S、N、T或V；X7是N或H；X8是T、S、P或A；X9是G、T、S或D；X
10
是S、M、N、Y、T、E或F；X
11
...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍文英，叶洪涛，周伟，刘浩，许文娟，崔智强，徐婷，范清林，宋礼华，
申请(专利权)人：安徽安科生物工程集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：