本发明专利技术涉及一种单克隆抗体下游纯化过程中有效去除宿主蛋白的方法，其包括(1)深层过滤细胞培养液，收集滤出液；(2)对步骤(1)得到的滤出液进行Protein A亲和层析；(3)对步骤(2)得到的样品进行病毒灭活，并对病毒灭活后的样品进行深层过滤，由此有效地去除包含单克隆抗体的样品中的宿主蛋白。本发明专利技术的方法采用了病毒灭活后深层过滤，同时对Protein A亲和层析和病毒灭活后的深层过滤工艺进行优化，通过Protein A亲和层析和病毒灭活后深层过滤两个纯化步骤就可将通过深层过滤收集的培养液上清中HCP的含量降至2.3ppm，经过进一步的阴和阳离子交换层析可将HCP的含量降至0.4ppm。
Method for effectively removing host proteins during downstream purification of monoclonal antibodies
The invention relates to a method for the effective removal of a host protein purification of monoclonal antibody in the downstream process, including (1) deep filtration cell culture liquid, collecting the filtrate; (2) to step (1) obtained the filtrate of Protein A affinity chromatography; (3) to step (2) to the samples of virus inactivation, and the inactivation of virus samples after deep filtration, thus effectively remove the contained monoclonal antibody in a sample of host proteins. The method of the invention adopts the virus inactivation after deep filtration and Protein A affinity chromatography and virus deep filtration process after optimized by Protein A affinity chromatography and virus inactivation after deep filtration two purification steps can be through the content of HCP in the culture supernatant of deep filtration collection to 2.3ppm, after Yin and cation exchange chromatography can be further HCP content to 0.4ppm.
【技术实现步骤摘要】
单克隆抗体下游纯化过程中有效去除宿主蛋白的方法
本专利技术涉及单克隆抗体的纯化技术，更具体地说涉及单克隆抗体下游纯化过程中有效去除宿主蛋白的方法。
技术介绍
现阶段单克隆抗体下游工艺平台一般主要包括发酵液澄清、捕获步骤、精纯步骤、病毒灭活与过滤、超滤浓缩。随着CHO细胞大规模培养技术的发展，细胞的蛋白表达水平得到了很大的提高，但伴随培养过程中外源营养物质的大量添加和细胞密度的呈数量级的增加，所以细胞培养产物中的成分越来越复杂。宿主蛋白HCP(HostCellProtein)就是其中一种复杂的污染物，宿主蛋白HCP的复杂性和异质性取决于表达系统、细胞株或者细胞培养条件。不同细胞株或者相同细胞株不同的上游细胞培养条件均会对宿主蛋白HCP污染物的种类和含量有较大影响。宿主蛋白HCP污染物的清除在生物制药工艺开发中是需要非常关注的，其在药物开发中的危险性在于其可以引起免疫原反应，为了保证病人用药的安全性这些过程相关的杂质需要被清除到一个低的水平，无论是在小试还是在放大阶段都是需要特别注意的，建立有效的去除宿主蛋白HCP的下游工艺条件并且在每一步工艺后有效的监控宿主蛋白HCP的去除效率，最终使其含量符合标准也是非常必要的。对于单克隆抗体工艺平台中HCP的去除方法主要包括深层过滤和层析方法。深层过滤：发酵液澄清深层过滤来完成培养液中的细胞和细胞碎片的去除。发酵料液的杂质主要包含完整细胞、死亡细胞产生的碎片、宿主蛋白HCP、DNA和可溶性小分子。深层过滤膜采用了疏松多空的纤维素骨架结构，并填充了硅藻土成分，进样端的表面孔径成漏斗状，这些结构摈弃了传统微滤表面截留结构易造成阻塞、过滤效率低的缺点，又具备了离心机所没有的截留小体积细胞碎片的优势，同时依靠硅藻土的吸附作用，能截留高达50％的DNA和15％的宿主蛋白HCP，这一点是其他处理方式所不具备的。层析方法包括粗纯步骤中的ProteinA亲和层析和精纯步骤中的离子层析(阴离子交换层析和阳离子交换层析)，ProteinA亲和层析由于其对单克隆抗体和Fc融合蛋白吸附的特异性其他杂质较难与ProteinA色谱相结合，可以清除很大比例的收获的细胞培养液中杂质。已有数据表明ProteinA亲和色谱层析可以有效的去除大于90％的宿主蛋白HCP，大多数的宿主蛋白HCP污染物经ProteinA亲和色谱时不与色谱结合而直接流穿。精纯步骤中的阴和阳离子交换层析可以去除其他仍然残留的微量杂质包括残留的工艺相关的杂质如：宿主蛋白HCP，DNA，内毒素，脱落蛋白A(leachedProteinA)和培养基添加物，和产品相关杂质如：高分子量聚体(Aggregate)，低分子量碎片。通常单克隆抗体经过粗纯步骤后各种杂质含量均已降低，但为了用药安全，还需精纯步骤进一步将杂质含量去除到原液质量标准以下。传统的单克隆抗体工艺平台中深层过滤、ProteinA亲和层析、一步或者两步精纯层析等几种下游纯化工艺均需要对HCP进行有效去除的去除，才能逐步将HCP含量降至可接受标准之内，但是HCP的含量很难被降低到10ppm，尤其是1ppm以下。
技术实现思路
本专利技术为克服现有技术中存在的问题而提供一种单克隆抗体下游纯化过程中有效去除宿主蛋白的方法。本专利技术一方面提供了一种单克隆抗体下游纯化过程中有效去除宿主蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(1)深层过滤细胞培养液，收集滤出液；(2)对步骤(1)得到的滤出液进行ProteinA亲和层析；(3)对步骤(2)得到的样品进行病毒灭活，并对病毒灭活后的样品进行深层过滤，由此有效地去除包含单克隆抗体的样品中的宿主蛋白。在本专利技术的另一个优选例中，所述细胞培养液是CHO细胞培养液。在本专利技术的另一个优选例中，步骤(2)中ProteinA亲和层析利用ProteinADiamond作为亲和层析的填料。在本专利技术的另一个更优选例中，ProteinA亲和层析所用的淋洗液为25mMTris-HCl，50mMNaCl，pH7.4±0.2。在本专利技术的另一个更优选例中，ProteinA亲和层析所用的洗脱液为100mM乙酸-乙酸钠pH3.6±0.2。在本专利技术的另一个优选例中，步骤(3)深层过滤使用X0HC深层过滤膜。在本专利技术的另一个优选例中，病毒灭活为S/D病毒灭活。在本专利技术的另一个更优选例中，S/D病毒灭活使用磷酸三丁酯(TnBP)作为助溶剂，使用聚山梨酯80作为表面活性剂。在本专利技术的另一个更优选例中，S/D病毒灭活中所用磷酸三丁酯的重量浓度为0.3％，所用聚山梨酯80的重量浓度为1％，在本专利技术的另一个更优选例中，S/D病毒灭活过程为将步骤(2)得到的样品的pH值调节至5.2±0.2，加入S/D至终浓度为0.3％TnBP+1％聚山梨酯80，室温孵育0.8-1.2小时。在本专利技术的另一个优选例中，步骤(3)得到的样品中宿主蛋白的含量为2.3ppm。在本专利技术的另一个优选例中，本专利技术的方法进一步包括依次用阴离子交换层析和阳离子交换层析处理步骤(3)所得的样品。本专利技术再一方面提供了一种含有低含量宿主蛋白的单克隆抗体制品，所述单克隆抗体制品按照以下方法制备：(1)深层过滤细胞培养液，收集滤出液；(2)对步骤(1)所得的滤出液进行ProteinA亲和层析；(3)对步骤(2)所得的样品进行病毒灭活，并对病毒灭活后的样品进行深层过滤；(4)对步骤(3)所得的样品进行阴离子交换层析；(5)对步骤(4)所得的样品进行阳离子交换层析；(6)对步骤(5)所得的样品进行超滤浓缩。在本专利技术的另一个优选例中，本专利技术提供的单克隆抗体制品中宿主蛋白不高于0.3ppm。在本专利技术的另一个优选例中，单克隆抗体制品中宿主蛋白为0.3ppm。在本专利技术的另一个优选例中，单克隆抗体制品中宿主蛋白为0.2ppm。在本专利技术的另一个优选例中，单克隆抗体制品中宿主蛋白为0.1ppm。具体实施方式针对现有技术中单克隆抗体下游纯化过程中宿主蛋白去除方面存在的缺陷，本专利技术人经过深入的研究，将病毒灭活后的样品用深层过滤处理，进一步优化了ProteinA亲和层析的条件和病毒灭活后的深层过滤条件。使用本专利技术的方法，可有效地将单克隆抗体制品中的宿主蛋白去除。在此基础上完成了本专利技术。因此本专利技术提供了一种单克隆抗体下游纯化过程中有效去除宿主蛋白的方法，该方法包括(1)深层过滤细胞培养液，收集滤出液；(2)对步骤(1)得到的滤出液进行ProteinA亲和层析；(3)对步骤(2)得到的样品进行病毒灭活，并对病毒灭活后的样品进行深层过滤，由此有效地去除包含单克隆抗体的样品中的宿主蛋白。本专利技术的方法中，单克隆抗体没有特别的限制，其可以是任何类型的单克隆抗体，例如IgG、IgA、IgE、IgD、IgM等类型。本专利技术的方法中，单克隆抗体是体外发酵生产的，使用的哺乳动物细胞包括但不局限与目前通过的各种杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。优选的是CHO细胞。本专利技术的方法中，通过深层过滤细胞培养液收集滤出液过程中对深层过滤没有特别的要求，所用的深层过滤膜和过滤条件只要能够使得到的滤出液可用于下一步的ProteinA亲和层析都是可以接受的。该步骤中所用深层过滤膜可以使用与病毒灭活后深层过滤步骤相同的过滤膜，也可以使用不相同的过滤膜。该步骤用于除去发酵料液的部分杂质，包含完整细胞、死亡本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种单克隆抗体下游纯化过程中有效去除宿主蛋白的方法，其中该方法包括以下步骤：(1)深层过滤细胞培养液，收集滤出液；(2)对步骤(1)得到的滤出液进行Protein A亲和层析；(3)对步骤(2)得到的样品进行病毒灭活，并对病毒灭活后的样品进行深层过滤，由此有效地去除包含单克隆抗体的样品中的宿主蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体下游纯化过程中有效去除宿主蛋白的方法，其中该方法包括以下步骤：(1)深层过滤细胞培养液，收集滤出液；(2)对步骤(1)得到的滤出液进行ProteinA亲和层析；(3)对步骤(2)得到的样品进行病毒灭活，并对病毒灭活后的样品进行深层过滤，由此有效地去除包含单克隆抗体的样品中的宿主蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养液是CHO细胞培养液。3.根据权利要求1所述的方法，其中ProteinA亲和层析利用ProteinADiamond作为亲和层析的填料。4.根据权利要求3所述的方法，其中ProteinA亲和层析所用的淋洗液为25mMTris-HCl，50mMNaCl，pH7.4±0.2。5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(3)深层过滤使用X0HC深层过滤膜。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒...
【专利技术属性】
技术研发人员：周新华，李晓辉，崔明明，张燕，尚玉桧，
申请(专利权)人：嘉和生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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