本发明专利技术公开了一种适合规模化高效纯化水溶性量子点与IgG类单克隆抗体偶联物的新方法，属生物技术领域。针对目前量子点抗体偶联物纯化工艺复杂，回收率低，难以实现规模化生产的弊端，本发明专利技术通过采用氨基葡萄糖封闭量子点与抗体偶联物的残留羧基，降低偶联产物的表面ζ电位，通过调整溶液pH值至4.5～5.0，进一步降低偶联产物在溶液中的净电荷含量、实现普通高速离心法规模化高效纯化量子点与抗体偶联物。本发明专利技术简化了量子点与抗体偶联物的实验操作流程，降低了对分离设备的要求，适合大批量纯化量子点IgG类单克隆抗体偶联物，得率在85%以上，且偶联产物的荧光特性以及生物活性未见明显变化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及纳米材料生物学修饰以及偶联物纯化的新方法。
技术介绍
自从1975年应用细胞融合技术首次制备出单克隆抗体以来，杂交瘤技术得到了迅速发展。大量的单克隆抗体被成功制备，并被广泛应用于免疫学、生物化学、药理学、细胞生物学、微生物学及临床等各个领域。目前已制备了小鼠、大鼠及人的杂交瘤细胞株，其中应用最广泛的仍然是小鼠杂交瘤细胞株。因此，鼠源性IgG类单克隆抗体自然而然地成为了一类最主要且应用最为广泛的单克隆抗体。该类抗体不仅具有重要的科研价值，而且具有巨大的商业价值。然而，鼠源性IgG类单克隆抗体不具有类似纳米材料的光、电等性质，因此在实际应用中往往需要结合其他的一些材料，如荧光物质、有机染料，磁性材料等。量子点(Quantum Dots, QDs)是一种由I1-VI或II1-V族元素组成的半导体纳米晶体(Semiconductor nanocrystals),由于量子点的极小物理尺寸,从而导致了一种量子限域效应，使得量子点显示出具有比常规有机染料、荧光蛋白更为优越的独特光学性质。首先，与常规有机染料相比，量子点的激发光谱宽且呈连续分布，其荧光发射光谱的半宽峰高与常规有机染料相比更窄，且呈对称分布。此外，量子点与常规荧光染料相比，激发和发射光谱之间的斯托克斯位移大，降低了量子点荧光信号的信噪比，大大提高了量子点的检测灵敏度。单个量子点的荧光强度是罗丹明染料的10-100倍之间，且量子点的荧光发射波长可通过调整量子点合成粒径的大小以及材料组分进行连续调谐，因此合成不同直径大小的量子点就能获得多种可以辨别的不同颜色荧光。由于不同尺寸大小的量子点能够采用单一波长的激发光产生不同颜色的荧光，因而可方便实现对生物组分的多元检测。量子点与常规有机染料或荧光蛋白相比，具有较强的抗光漂白功能。量子点在连续光激发条件下，其荧光发射强度随时间变化不明显，而Alexa 488在没有添加抗漂白剂的情况下荧光强度呈指数下降。总之，作为一种新型的荧光标记物，量子点具有比常规有机染料以及荧光蛋白更为显著的优势，目前已广泛应用于细胞标记、活体细胞成像、活体动物体内荧光显微成像以及荧光标记的免疫学快速诊断技术等领域。其中羧基功能团表面的水溶性量子点应用最为广泛，采用多羧基以及疏水链的两性聚合物是油溶性量子点转化为羧基表面的水溶性量子点最常用方法。然而，量子点并不具有抗体分子的特异性和选择性，因此往往需要在其表面偶联上抗体分子形成量子点单克隆抗体偶联物。这样，这种偶联物就同时拥有了量子点的光学特性和抗体分子的特异性和选择性。水溶性羧基化量子点与IgG类单克隆抗体常用偶联方法为EDC/NHSS介导的活泼酯方法。在水溶性羧基化量子点与IgG类单克隆抗体偶联过程中，将量子点IgG类单克隆抗体偶联物与溶液中游离IgG类单克隆抗体进行高效分离，是保证量子点IgG类单克隆抗体偶联物广泛使用的前提。目前，量子点单克隆抗体偶联物纯化方法主要包括以下几种。第一，超速离心方法。由于·水溶性量子点纳米粒子粒径小，比表面积大，纳米材料与单克隆抗体偶联物表面含有大量的羧基，因此采用常规离心(低于30，000 g离心力)，量子点单克隆抗体偶联物回收效率普遍偏低(小于50%)，若要将量子点单克隆抗体偶联物回收效率提高至85%以上，离心速度一般需大于50，000 g。第二种，凝胶色谱法。该方法利用量子点单克隆抗体偶联物与单克隆抗体的分子量差异(表现为光学以及水化粒径的差异)，利用排阻层析原理进行分离。第三种，超滤分离法。该法利用超滤管的超滤膜截流分子量差异将单克隆抗体与量子点单克隆抗体偶联物进行分离的一种方法。同时还有基于琼脂糖凝胶以及琼脂糖-聚丙烯酰胺杂合凝胶电泳等的纯化分离方法。总之，利用以上纯化方法虽然可以获得较高质量的量子点单克隆抗体偶联物，但仍存在操作条件苛刻，流程复杂，得率低等缺陷，很难实现规模化生产。
技术实现思路
水溶性量子点是一种良好的纳米荧光标记材料，该材料通过与单克隆抗体、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G以及配体或受体分子偶联，可广泛应用于细胞标记、活体细胞成像、活体动物体内荧光显微成像以及免疫快速诊断等诸多领域。但是传统的量子点单克隆抗体偶联物纯化方法存在操作条件苛刻，流程复杂，得率低以及很难实现规模化生产等缺陷。本专利技术的目的是提供一种操作简便、分离效率高、大批量纯化水溶性量子点IgG类单克隆抗体的新方法，具体包括以下步骤: 纯化量子点与IgG类单克隆抗体偶联物的方法，包括如下步骤:(I)将水溶性羧基修饰的量子点活化，加入IgG类单克隆抗体溶液，调整溶液pH至7.0~9.0后，偶联反应；(2)偶联反应结束后，溶液中加入氨基葡萄糖封闭偶联产物中量子点表面残留的羧基，将反应溶液PH值调整至弱酸性；(3)高速离心，弃上清液，取沉淀。步骤(3)后，还有将沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L pH 7.0~7.5磷酸盐缓冲液溶解步骤。所用量子点为羧基化两亲聚合物修饰的水溶性羧基量子点。所述步骤(1)中活化为将水溶性羧基修饰的量子点溶解于pH 5.0~6.0,0.05mol/L硼酸盐缓冲液中，分别加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37°C反应2小时,活化量子点羧基。所述1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺与量子点的摩尔比均为100~200:1，优选为150:1 ;所述IgG类单克隆抗体与量子点的摩尔比为I~10:1 ; 偶联反应结束后，溶液中加入氨基葡萄糖至氨基葡萄糖终浓度为1.5~3%，充分混匀15~30分钟； 步骤(2)中将反应溶液pH值调整至弱酸性为将pH值调整至4.5~5.0，优选为4.5 ； 步骤(3)所述高速离心离心力为28，000~30，000g。所述IgG类单克隆抗体为抗黄曲霉毒素BI单克隆抗体、抗赭曲霉毒素单克隆抗体、抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体、抗恩诺沙星单克隆抗体、抗盐酸克伦特罗单克隆抗体、抗沙丁胺醇单克隆抗体、抗孔雀石绿单克隆抗体、抗莱克多巴胺单克隆抗体、抗沙门氏菌单克隆抗体、抗志贺氏菌单克隆抗体、或抗空肠弯曲菌单克隆抗体。原理见图1。水溶性羧基修饰的量子点为核壳结构的量子点，壳层由双亲聚合物组成，外部为大量亲水羧基表面，内层为长链疏水基团，通过与三辛基氧化磷的疏水作用将油溶性量子点包裹在壳层内部。将量子点溶解于PH 6.0,0.05 mol/L硼酸盐缓冲液中，分别加入摩尔比为100~200:1的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37°C反应2小时，将量子点表面羧基转化为酸性条件下稳定的活泼酯。加入IgG类单克隆抗体溶液，其中鼠源性IgG类单克隆抗体与量子点摩尔比为10:1，用I M NaOH溶液调整溶液pH至7.0~9.0。在pH 7.0~9.0条件下，IgG类单克隆抗体氨基酸残基中的氨基易于质子化，而量子点表面活泼酯化的羧基在弱碱性条件下发生水解，与质子化氨基偶联形成稳定的酰胺键，从而将IgG类单克隆抗体偶联至量子点表面。量子点与IgG类单克隆抗体偶联后，由于空间位阻的原因，量子点表面仍会残留大量未被偶联的羧基，因此量子点IgG类单克隆抗体偶联物本文档来自技高网...
【技术保护点】
纯化量子点与IgG类单克隆抗体偶联物的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将水溶性羧基修饰的量子点活化，加入IgG类单克隆抗体溶液，调整溶液pH至7.0～9.0后，偶联反应；（2）偶联反应结束后，溶液中加入氨基葡萄糖封闭偶联产物中量子点表面残留的羧基，将反应溶液pH值调整至弱酸性；（3）高速离心，弃上清液，取沉淀。
【技术特征摘要】
1.纯化量子点与IgG类单克隆抗体偶联物的方法，其特征在于包括如下步骤:(1)将水溶性羧基修饰的量子点活化，加入IgG类单克隆抗体溶液，调整溶液pH至7.0~9.0后，偶联反应；(2)偶联反应结束后，溶液中加入氨基葡萄糖封闭偶联产物中量子点表面残留的羧基，将反应溶液PH值调整至弱酸性；(3)高速离心，弃上清液，取沉淀。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)后，还有将沉淀用含25%甘油，0.01%NaN3的0.05 mo I/L pH 7.0~7.5磷酸盐缓冲液溶解步骤。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所用量子点为羧基化两亲聚合物修饰的水溶性羧基量子点。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中活化为将水溶性羧基修饰的量子点溶解于pH 5.0~6.0，0.05 mol/L硼酸盐缓冲液中，分别加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37°C反应2小时，活化量子点羧基。5.如权利要求4所述的方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊勇华，许恒毅，罗薇，许杨，魏华，徐威，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：
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