一种提高乳酸菌耐胁迫能力的GAD基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种提高乳酸菌耐胁迫能力的GAD基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。所述基因可用于提高乳酸菌耐低温胁迫能力和耐酸胁迫能力。具体方法是向乳酸菌中引入含有GAD基因的重组质粒，通过在乳酸菌中过量表达合成γ‑氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶CsGAD以提高乳酸菌耐低温胁迫能力和耐酸胁迫能力。从而提高乳酸乳球菌在低温和酸性环境下的存活率，可用于多种保健食品的开发应用，为工业化生产提供良好的保证。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及到一种利用基因工程技术内源表达GABA以改良乳酸菌耐胁迫性能的基因及其应用。
技术介绍
乳酸菌(Lacticacidbacteria,LAB)是一群形态、代谢性能和生理学特征不完全相同的革兰氏阳性菌的总称。乳酸菌普遍存在于人类和动物的肠道中，被人们一致认同是安全级的微生物。乳酸菌具有抑制病原微生物在肠上皮细胞表面黏附、定植和侵袭肠上皮细胞的功能，乳酸菌的代谢产物也具有阻止病原微生物入侵生物屏障作用。由于乳酸菌对动植物和人体均具有良好的益生作用，乳酸菌又被称为“益生菌”，在乳制品及相关产品的生产、制作植物发酵型蛋白饮料、蔬菜深加工等领域有广泛的开发运用。但是在大规模的工业化生产过程中，乳酸菌无法避免的面临各种不利条件影响其生长发育。包括“低温胁迫”和“酸胁迫”。乳酸菌是嗜温微生物，温度过高过低都会影响乳酸菌的生长增殖。但是在工业化的生产、运输过程中为了保证乳酸菌制品的质量，必须对其进行低温贮存，这样不可避免的会对乳酸菌造成一定的伤害。在冷冻过程会导致细胞膜上形成大量冰晶，导致细胞膜损伤，进而导致细胞的生理、代谢功能受到损伤。同时温度下降会导致细胞中的水分含量减少，胞内外的电解质浓度增加，造成“溶质效应”。此外，低温时，DNA糖基键的断裂使碱基产生了质子化作用，DNA产生脱嘌呤和脱嘧啶反应，使得DNA在自我修复过程中的错误率极大提高了，这可能会产生生物突变体，也是细胞丧失生命力的重要因素之一。与此同时，乳酸菌作为嗜中性微生物，是发酵生产酸性物质的典型菌株，乳酸菌在增殖过程中所产生的乳酸、乙酸等酸性物质发挥着双重作用。一方面，乳酸菌代谢所产生的高浓度酸抑制了其他微生物的生长增殖，增强了食品的货架保存期，并且可以与醛类、酮类等食品中的一些物质发生反应，进而产生了芳香类化合物，赋予了食品独特的风味。但是如果外界的生长环境过于偏酸性时乳酸菌的代谢和生长就会遭到抑制；同时，由于乳酸菌细胞结构的影响，高浓度的酸会使细胞质中大量积累质子，随即会使得细胞内呈酸性即pH值降低，使得跨膜△pH受到影响，消耗乳酸菌内的质子推动力。进一步影响乳酸菌的生物活性和增殖能力。目前国内外鲜有直接提高乳酸菌抗性的报导。但是却有研究者通过别的研究方法来间接的帮助乳酸菌抵御外界胁迫环境。例如，可与通过调控氨基酸代谢来提高乳酸菌的抵御酸胁迫能力；通过调控细胞膜上脂肪酸的组成进而调控细胞膜和细胞壁的生理功能来提高乳酸菌的抗性；通过引入别的代谢途径来改善乳酸菌的抗性等，但是尚无报道表明能同时提高乳酸菌的抗酸和抗低温能力，因此提供一种提高乳酸菌综合胁迫抗性的方法尤为重要。γ-氨基丁酸作为一种广泛存在于生物体内的非蛋白质氨基酸，主要由L-谷氨酸经谷氨酸脱羧酶(glutamicaciddecarboxylase，GAD)脱羧而成，作为三羧酸循环的重要支路参与氨基酸代谢。同时参与到多种生物体的生长发育和抵御环境胁迫过程中，异源表达高产GABA的GAD基因有助于参与乳酸菌抗胁迫能力的改良。因此，研究GABA在乳酸菌增殖过程中所扮演的角色具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高乳酸乳球菌耐受低温胁迫和酸胁迫能力的GAD基因及其应用，向乳酸菌中引入含有所述GAD基因的质粒，通过在乳酸菌中过量表达合成γ-氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶CsGAD以提高乳酸菌耐低温胁迫能力和耐酸胁迫能力，从而提高乳酸乳球菌在低温和酸性环境下的存活率，为工业化生产提供良好的保证。本专利技术所请求保护的技术方案如下：本专利技术的目的之一请求保护一种提高乳酸菌耐胁迫能力的GAD基因，所述基因序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术目的之二是请求保护一种蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示.。本专利技术的目的之三是请求保护一种构建体，所述构建体包含编码SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。本专利技术的目的之所四是请求保护一种构建重组菌的方法，包括以下步骤：a、将所述GAD基因连接到表达载体上获得重组质粒；b将重组质粒转化到宿主菌中获得重组菌。本专利技术的目的之所五是请求保护该基因在提高乳酸菌耐胁迫能力中的应用。所述应用中，乳酸菌耐胁迫能力是指耐低温胁迫能力和耐酸胁迫能力。本专利技术的目的之六是请求保护一种生产食品级γ-氨基丁酸的方法，该方法是向乳酸菌中引入含有GAD基因的构建体，通过GAD基因在乳酸菌中过量表达合成γ-氨基丁酸，由于乳酸菌的表达系统本身是食品级的，可以以达到生产富含具有保健效果γ-氨基丁酸的乳酸菌的目的。与已有技术相比，本专利技术有益效果表现在：本专利技术GAD基因，通过在乳酸菌中过量表达合成γ-氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶CsGAD以提高乳酸菌耐低温胁迫能力和耐酸胁迫能力，从而提高乳酸乳球菌在低温和酸性环境下的存活率，同时产生的γ-氨基丁酸可用于多种保健食品的开发应用，为工业化生产提供良好的保证。附图说明图1是本专利技术实施例中正常培养条件下重组菌与对照菌的生长曲线。图2是本专利技术实施例中对数期中期重组菌与对照菌在低温冷冻胁迫下生长情况对比。图3是本专利技术实施例中稳定期前期重组菌与对照菌在低温冷冻胁迫下生长情况对比。图4是本专利技术实施例中稳定期后期重组菌与对照菌在低温冷冻胁迫下生长情况对比。图5是本专利技术实施例中重组菌与对照菌在酸胁迫下生长情况对比。图6是重组菌电泳图谱。图6中，M：Marker(蛋白分子量标记)；1：空载体诱后；2：重组载体诱前；3：重组载体诱后；4：重组载体诱前上清；5：重组载体诱后上清；6：重组载体诱前沉淀；7：重组载体诱后沉淀。具体实施方式以下结合附图通过具体实施方式对本专利技术技术方案做进一步解释说明。1.重组表达菌株的构建：扩增本专利技术人前期克隆自茶叶叶片中的CsGAD基因序列，该并将其连接到乳酸乳球菌表达载体pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148-CsGAD，再将其电转化入宿主菌L.lactisNZ9000中，得到重组菌株L.lactisNZ9000-CsGAD(乳酸菌L.lactisNZ9000以及表达质粒载体pNZ8048购于湖南长沙赢润生物技术有限公司)。详细步骤如下：(1)根据已经获得的茶树GAD基因序列，序列如SEQIDNO.1所示，运用Primer5.0软件在序列的5’和3’设计一对引物：CsGAD-upCCGCCATGGATGGTTCTCTCAAAGATTGCNcoI酶切位点CsGAD-downCCCAAGCTTCTAGCAAATCACTTGTGTHindIII酶切位点利用高保真酶从提取的茶树叶片cDNA中进行PCR扩增，对所得的PCR产物进行纯化回收，回收产物利用普通Taq酶进行加“A”反应(常规操作)后再次回收连接入克隆载体pMD19-T，构建pMD19-CsGAD质粒并转化入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，氨苄青霉素平板培养过夜后挑取阳性克隆测序。(2)确定测序结果与原始序列无误后，对提取的高浓度pMD19-CsGAD质粒和pNZ8148质粒(商品化的空表达载体)进行NcoI和HindIII酶的双酶切，回收酶切产物后用T4连接酶进行连接反应，获得pNZ8148-CsGAD表达载体，再次转化入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，培养过夜后挑菌测序。(3)测序确定结果无误后，摇菌提取pNZ8148-C本文档来自技高网...

【技术保护点】
提高乳酸菌耐胁迫能力的GAD基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.提高乳酸菌耐胁迫能力的GAD基因，其特征在于，所述基因序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示.。3.一种构建体，其特征在于，所述构建体包含编码SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。4.一种构建重组菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、将权利要求1所述的基因连接到表达载体上获得重组质粒；...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈琪，赵颖，伍赟，付瑞燕，梅林，宛晓春，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34