转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了转基因苜蓿草KK179‑2品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。本发明专利技术基于转基因苜蓿草KK179‑2的5’端外源插入片段与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计检测引物和探针，建立了转基因苜蓿草KK179‑2品系特异性实时定量荧光PCR检测方法，该检测方法定量检测下限为20copy/μL的转基因苜蓿草品系KK179‑2基因组DNA，建立的标准曲线线性相关系数(R2)为0.99，扩增效率E为105％，重复性好，具有特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确并可定量检测的优点，适用对转基因苜蓿草KK179‑2进行品系特异性筛查，可为我国出入境口岸对进境转基因苜蓿草的监管提供有力技术支撑。

Transgenic alfalfa KK179-2 strain specific real-time fluorescence PCR detection primer, probe, detection kit and detection method

The present invention discloses transgenic alfalfa KK179 2 strain specific primers and probe real-time fluorescence PCR detection, detection kit and detection method. The invention is based on Transgenic Alfalfa KK179 2 5 'end inserted adjacent sequence design primer and probe for detecting between the fragment and the alfalfa genome DNA, established transgenic alfalfa KK179 2 strain specific real-time quantitative PCR detection method of transgenic alfalfa lines KK179 the detection method of quantitative detection the lower limit for 20copy/ L 2 genome DNA, the standard curve linear correlation coefficient (R2) was established in 0.99, the amplification efficiency of E was 105%, with good repeatability, good specificity, high sensitivity, strong stability, and has the advantages of fast and accurate quantitative detection for transgenic alfalfa, 2 strains of KK179 specific screening, for China's entry and exit ports of entry of transgenic alfalfa regulation provides powerful technical support.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。
技术介绍
苜蓿草(Alfalfa)是美国继玉米、小麦、大豆后第四大农作物，因其蛋白含量约占总干草质量的17％～20％，在美国及全球都是一种重要的饲料作物，全球种植面积约3000万公顷，转基因苜蓿草KK179-2是由孟山都公司和ForageGeneticsInternational(FGI)开发的转基因低木质素苜蓿品种，商品名为HarvXtraTM，2014年11月10日获得美国农业部(USDA)动植物卫生检疫局(APHIS)批准种植。2014年5月1日，澳新食品标准局(FSANZ)批准转基因苜蓿草KK179-2用于食品。转基因苜蓿草KK179-2目前尚未获得我国农业部转基因生物安全证书。与传统苜蓿相比，KK179-2的木质素最高可减少22％，更加容易被草食动物消化。低木质素的苜蓿品系KK179-2不同于传统的苜蓿之处在于其基因组中插入了一个咖啡酰CoA甲基转移酶(CaffeoylCoA3-O-methyltransferase,CCOMT)编码序列，CCOMT是参与G型木质素生物合成路径的酶。该片段引入的方式为反向重复序列，表达时可以产生双链RNA，从而产生RNA干扰(RNAinterference,RNAi)，抑制内源CCOMTRNA的翻译及CCOMT酶的水平，导致KK179-2的G木质素含量降低进而减少苜蓿木质素整体含量。目前我国奶牛存栏数为1500万头，对优质饲草需求量非常大。转基因苜蓿草通过饲料进入动物养殖的食物链，存在一定食品安全风险。为保障消费者的知情权，转基因产品标识制度在30多个国家和地区应用。凡是在中国境内销售的转基因生物，必须进行标识。目前各国强制标识的转基因限量各不相同。欧盟和俄罗斯为0.9％，韩国和日本分别是3％和5％，中国目前实施无阀值的强制性标识制度。转基因产品标识制度的实施需要相应检测方法作为支撑。品系特异性检测方法是基于外源插入片段和宿主基因接合区的边界序列建立特异性的检测方法，品系特异性检测可以区分转化于同一类质粒的不同基因品系，如油菜的Rf1和Rf2，被认为是最适合转基因标识的检测判定方法。zimmmermanm等首次使用inversePCR策略获得Bt11的接合区序列并建立品系特异性检测方法。目前已有多种转基因作物品系如大豆A2704-12、A5547-127、转基因油菜品系Topasl9/2、转基因棉花GHB119、转基因水稻B2A68等建立了相关的品系特异性检测方法。目前对转基因产品的检测应用最广泛的是荧光PCR检测技术，相较普通PCR技术，它具更高的灵敏度、特异性和稳定性。可通过荧光信号的积累实现实时监测整个PCR进程，而后通过扩增曲线和标准曲线对未知模板进行定性或定量分析。有效的检测方法是转基因监管的技术支撑，而目前缺少转基因苜蓿草KK179-2品系特异性的检测方法，因此急需开发相应的检测方法以满足转基因苜蓿草KK179-2品系监管的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确的转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。本专利技术基于KK179-2的5’端外源插入片段与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针，建立了转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时定量荧光PCR检测方法，适用于对转基因苜蓿草KK179-2进行品系特异性筛查。本专利技术的转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：KK179-2-F：5’-TCGAATCAAACCACAATTGATA-3'(如SEQIDNO.1所示)；KK179-2-R：5’-TGACCATCATACTCATTGCTGA-3'(如SEQIDNO.2所示)。本专利技术还提供了转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：KK179-2-P：5’-TTCCCGGACATGAAGCCATTTACA-3'(如SEQIDNO.3所示)，检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。优选，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为TAM。本专利技术的转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：KK179-2-F：5’-TCGAATCAAACCACAATTGATA-3'(如SEQIDNO.1所示)；KK179-2-R：5’-TGACCATCATACTCATTGCTGA-3'(如SEQIDNO.2所示)；所述的检测探针如下所示：KK179-2-P：5’-TTCCCGGACATGAAGCCATTTACA-3'(如SEQIDNO.3所示)，检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。本专利技术的转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取样品DNA的作为模板；(2)加入上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；(3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品中是否含有转基因苜蓿草KK179-2。优选，所述的步骤(2)的扩增反应体系为：PremixExTaqTM10μL，10μmol/L检测引物KK179-2-F和KK179-2-R各0.4μL，ROXReferenceDyeII0.2μL，检测探针KK179-2-P0.6μL，DNA模板2μL和ddH2O6.4μL；所述的步骤(3)的实时荧光PCR反应，其反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。所述的步骤(3)的根据扩增曲线判断样品中是否含有转基因苜蓿草KK179-2的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品中含有转基因苜蓿草KK179-2；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品中不含有转基因苜蓿草KK179-2。本专利技术还提供转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取转基因苜蓿草KK179-2基因组DNA进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，分别加入上述的检测引物、检测探针，与本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因苜蓿草KK179‑2品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：KK179‑2‑F：5’‑TCGAATCAAACCACAATTGATA‑3'；KK179‑2‑R：5’‑TGACCATCATACTCATTGCTGA‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检
测引物如下所示：
KK179-2-F：5’-TCGAATCAAACCACAATTGATA-3'；
KK179-2-R：5’-TGACCATCATACTCATTGCTGA-3'。
2.一种转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检
测探针如下所示：
KK179-2-P：5’-TTCCCGGACATGAAGCCATTTACA-3'，检测探针的5’端标记有荧光
报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特
征在于，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为TAM。
4.一种转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量
PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如
下所示：
KK179-2-F：5’-TCGAATCAAACCACAATTGATA-3'；
KK179-2-R：5’-TGACCATCATACTCATTGCTGA-3'；
所述的检测探针如下所示：
KK179-2-P：5’-TTCCCGGACATGAAGCCATTTACA-3'，检测探针的5’端标记有荧光
报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
5.一种转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下
步骤：
(1)提取样品的DNA作为模板；
(2)加入权利要求1所述的的检测引物和权利要求2所述的检测探针，与实时荧光定
量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
(3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩
增曲线判断样品中是否含有转基因苜蓿草KK179-2。
6.根据权利要求5所述的转基因苜蓿草KK...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘二龙，卢丽，吕英姿，刘津，蒋湘，李嘉琪，杜雅萍，林学勤，郑高彬，
申请(专利权)人：黄埔出入境检验检疫局综合技术服务中心，
类型：发明
国别省市：广东;44