水飞蓟素脂质纳米粒的制备及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种水飞蓟素脂质纳米粒，通过制备水飞蓟素脂质纳米粒，结合自闭症实验动物模型，从整体动物水平，对水飞蓟素脂质纳米粒的药效学指标进行评价，证明其具有良好的脑炎症病灶区的靶向性，可使药物在炎症区域内富集，提高药物的生物利用度，降低药物用量。本发明专利技术可以为临床治疗自闭症提供了新的实验依据和思路，可作为更加高效、低毒的载药系统在制备自闭症炎症干预药物中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，涉及靶向递药系统，具体涉及一种用于治疗自闭症的脑靶向递药系统，尤其是一种水飞蓟素脂质纳米粒的制备方法和应用。
技术介绍
自闭症是神经系统发育失调导致的一种大脑广泛性发育障碍。自闭症影响人社会交往技能的发展和人际沟通能力，,常在3岁前发病。其病因多样，但具体发病机制尚不清楚。目前认为，该病可能是环境因素与遗传易感性共同作用的结果。研究发现，自闭症的发生与氧化应激及炎症反应有一定相关性，自闭症患者脑内存在炎症反应异常的现象，表现为致炎细胞因子增多，这些致炎因子与自闭症患者缺乏社交能力，抵抗新事物以及睡眠紊乱等症状有关。脑内炎症反应和氧化应激增加可能会导致炎症，激活小胶质细胞。因此，可能是炎症反应致使小胶质细胞活化从而促进脑部病变和临床症状。由此，利用抗炎药物治疗自闭症受到人们的关注，而中药抗炎药，因其药效好、不良反应少以及来源丰富等优势，越来越受到人们的重视，研究和开发新的具有抗炎活性成分的中药也逐渐成为热点。水飞蓟素是传统的中药，近来研究发现，其有很好的抗炎效果。由于小分子药物透过血脑屏障的能力有限，许多研究认为血脑屏障是脑部疾病治疗的瓶颈。因此通过设计新型的脑靶向载药系统，克服血脑屏障的阻碍，提高传统药物的疗效、增加治疗窗。纳米粒是目前研究较多的一类用于脑部靶向治疗的递药载体系统，包括如下优点：具有特异性，靶向性，定量准确、易吸收，具有适当的粒径与粒型，颗粒小；可减少药物降解，r>提高药物稳定性；具有较高的载药量，具有在靶部位定位的能力，减少给药剂量，进一步减少或避免药物的毒副作用；具有较长的体内循环时间，增加脑靶向效率。基于以上背景，我们主要研究基于炎症反应的自闭症发病机制，并利用自闭症动物模型给予中药抗炎药治疗，检测药物对自闭症动物炎症反应的干预作用。具体方法是以BTBRT+tf/J鼠为自闭症动物模型，并分别用水飞蓟素及其纳米粒对BTBRT+tf/J鼠炎症反应进行药理干预，主要评价药物对该自闭症模型小鼠脑部海马区和皮层的神经生物化学分子标志物变化。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供水飞蓟素脂质纳米粒，通过以下制备步骤实现：取硬脂酸270mg、中链甘油三酯(MCT)90mg、水飞蓟素40mg，加入2mL无水乙醇中，水浴60℃下加热搅拌使其溶解，趁热将上述溶液缓慢注入18mL含有0.1％(质量百分数)吐温80的纯净水中，60℃磁力搅拌5min，室温搅拌冷却至室温，呈乳黄色，既得2mg/mL水飞蓟素脂质纳米粒溶液。其中脂质纳米粒的材料不限于单硬脂酸甘油酯、中链甘油三酯等，可以是其他常用的脂肪酸甘油酯。本专利技术的另一个目的是提供所述水飞蓟素脂质纳米粒在制备自闭症炎症干预药物中的应用。所述脂质纳米粒作为给药载体在制备自闭症药物中的应用。本专利技术所述的应用通过以下步骤实现：利用BTBRT+tf/J鼠为自闭症动物模型。实验分组：正常对照组、自闭症模型组、水飞蓟素给药组(100mg/kg)、水飞蓟素纳米粒组(20mg/kg)、地塞米松组(0.125mg/kg，阳性药组)。各组小鼠每天灌胃给药，连续给药30天。小鼠给药30天后进行对炎症干预作用的评价。评价指标：(1)脑内炎症病灶区药物累积成像：将加入荧光材料的脂质纳米粒对小鼠灌胃给药，分别在给药2h、4h、6h、8h后观察各给药小鼠的脑部荧光分布情况。荧光脂质纳米粒在小鼠脑部的时效累积荧光强度成像，如图1。结果表明，脂质纳米粒具有很好的脑靶向性，能有效的穿通血脑屏障，且2h时累积荧光强度最大，随后慢慢减弱，到8h时几乎没有看到荧光，说明给药2h时进入脑内的纳米粒最多，随后随着体内纳米粒的代谢和消除，其含量逐渐减低，到8h后几乎消失。(2)免疫印迹检测：连续给药30天后，取各组小鼠的脑部海马和皮层区，用免疫印迹法考察皮层和海马中炎症相关蛋白Caspase-1、CathepsinB、IL-1β和NLRP3的表达变化，表征炎症干预程度，免疫印迹及定量见图2-图9。结果显示，炎症相关蛋白的检测结果发现BTBR组炎症小体信号激活，CathepsinB蛋白表达上调，导致下游的Caspase-1也随之上调，然而处于下游另一条通路上的NLRP3并没有受到影响，Caspase-1下游的IL-1β由于是分泌型蛋白，我们并未发现该蛋白表达上调。而给药组的CathepsinB和下游的Caspase-1表达下调，说明水飞蓟素及其纳米粒都达到了一定的抗炎效果，且由于水飞蓟素纳米粒组的剂量是水飞蓟素组的1/5，可以得出水飞蓟素纳米粒的药效增强。(3)免疫荧光检测：连续给药30天后，取各组小鼠含海马和皮层区的脑部切片，用免疫荧光法考察炎症相关蛋白IL-1β的表达变化及小胶质细胞的形态改变。结果如图10-图17所示，相较于对照组，模型组BTBR小鼠海马和皮层中IL-1β的表达上调，进一步证实BTBR确实有炎症小体信号激活。同时在共聚焦显微镜下观察到模型组小胶质细胞形态变化明显，胞体相对增大，突起回缩，呈现出激活状态。而相较于模型组，水飞蓟素及其纳米粒组BTBR小鼠海马和皮层中IL-1β的表达下调，小胶质细胞的胞体减小，突起伸展拉长，恢复静息状态，说明水飞蓟素及其纳米粒有效的干预了炎症，且由于水飞蓟素纳米粒组的剂量是水飞蓟素组的1/5，可以得出水飞蓟素纳米粒的药效增强。本专利技术提供的水飞蓟素脂质纳米粒具有很好的脑靶向性，尤其是在炎症病灶区分布量多，在较小的剂量下产生明显的炎症干预作用，有利于减少药物在非病灶区的毒副作用；内载药物从载体中释放具有缓释作用，载体材料无毒、可生物降解和生物相容性好，可应用于治疗自闭症及相关疾病。本专利技术通过制备水飞蓟素纳米粒，结合自闭症实验动物模型，从整体动物水平，对水飞蓟素脂质纳米粒的药效学指标进行评价，证明其良好的脑靶向性及对脑部炎症明显的干预作用。从炎症小体信号激活和小胶质细胞变形活化等指标，证明该脂质纳米粒可以有效调控自闭症的炎症，从而为临床治疗自闭症提供了新的实验依据和思路，并提供更加高效、低毒的载药系统。本专利技术的有益之处是：(1)采用纳米技术，可以有效提高不溶性载药的溶解度，增强药效。(2)将水飞蓟素制成纳米粒后，可以提高在炎症病灶区分布量，在较小的剂量下产生明显的改善作用，有利于减少药物在非病灶区的毒副作用。(3)脂质纳米粒载药系统具有缓释作用，延长作用时间。本专利技术的突出优点在于，创新性地采用具有临床应用潜力的自闭症脑部炎症病灶区靶向系统——水飞蓟素脂质纳米粒，实现中药抗炎药物的脑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水飞蓟素脂质纳米粒，其特征在于，通过以下步骤制备：取硬脂酸270mg、中链甘油三酯90mg、水飞蓟素40mg，加入2mL无水乙醇中，水浴60℃下加热搅拌使其溶解，趁热将上述溶液缓慢注入18mL含有0.1％吐温80的纯净水中，60℃磁力搅拌5min，室温搅拌冷却至室温，呈乳黄色，既得2mg/mL水飞蓟素脂质纳米粒溶液。

【技术特征摘要】
1.一种水飞蓟素脂质纳米粒，其特征在于，通过以下步骤制备：
取硬脂酸270mg、中链甘油三酯90mg、水飞蓟素40mg，加入2mL无水乙醇中，水浴
60℃下加热搅拌使其溶解，趁热将上述溶液缓慢注入18mL含有0.1％吐温80的纯净水中，
60℃磁力搅拌5min，...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩峰，王平，孙盟盟，卢应梅，杜永忠，张硕，高银萍，王成坤，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33