本发明专利技术公开了一种包含喜树碱的层层自组装纳米靶向载体的制备方法，所述方法以羟基喜树碱（HCPT）为模型药物，以天然无毒可降解生物材料壳聚糖为基础材料，利用甘草次酸受体介导的肿瘤主动靶向技术，制备能够响应肿瘤组织及肿瘤细胞特殊的氧化还原和pH环境的层层自组装纳米粒子。该方法制备的靶向纳米囊单分散性高，囊壁厚度和空腔体积可控，纳米囊具有还原响应性，可以针对肿瘤细胞的微环境控制释放内腔的抗肿瘤药物，可作为抗肿瘤药物的靶向运输工具，在肿瘤的靶向治疗领域具有很大的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种包含喜树碱的层层自组装纳米靶向载体的制备方法
本专利技术属于高分子药物载体
，涉及一种包含喜树碱的层层自组装纳米靶向载体的制备方法。
技术介绍
中国平均每年新发肿瘤病例三百多万，年均死亡病例高达270万。研究者渴望探索出治疗恶性肿瘤的有效方法，目前有效的治疗途径仍然是手术、化疗和放疗。应用于临床的化疗药物靶向性不强，不能准确识别肿瘤细胞或肺肿瘤细胞。在治疗过程中不仅杀死肿瘤细胞同时也可能造成机体增生较快的正常细胞损伤或死亡，因而产生严重的副作用。生物医用高分子材料是目前功能性高分子发展趋势非常蓬勃的一个领域。在高分子药物载体方面，基于功能高分子材料设计而成的纳米颗粒、纳米囊的传递系统成为研究热门。这些材料生物相容性高，载药量大，可以通过配体修饰而具有靶向功能，同时可引入刺激响应性基团以调节药物在体内的释放和分布。许多具抗癌药物都是水难溶性药物，例如羟基喜树碱（Camptothecin，HCPT）等，其在水中的溶解度约为1μg/mL，难容的特性严重阻碍了其抗癌功效和临床应用，解决这一问题的有效方法是利用纳米载体运载此类药物。因此，设计合成具有靶向性强、控制释放能力高的药物传递系统具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种包含喜树碱的层层自组装纳米靶向载体的制备方法，将还原敏感性壳聚糖衍生物、ι-卡拉胶分别交替沉积在负载HCPT的磷酸钙球形胶体微粒表面以制备还原响应性靶向微胶囊，该方法制备的靶向纳米囊单分散性高，囊壁厚度和空腔体积可控，纳米囊具有还原响应性，可以针对肿瘤细胞的微环境控制释放内腔的抗肿瘤药物，可作为抗肿瘤药物的靶向运输工具，在肿瘤的靶向治疗领域具有很大的应用前景。一种包含喜树碱的层层自组装纳米靶向载体的制备方法，以羟基喜树碱（HCPT）为模型药物，以天然无毒可降解生物材料壳聚糖为基础材料，利用甘草次酸受体介导的肿瘤主动靶向技术，制备能够响应肿瘤组织及肿瘤细胞特殊的氧化还原和pH环境的层层自组装纳米粒子。具体步骤如下：a、还原敏感性壳聚糖衍生物制备：（1）以ε-己内酯（ε-CL）为单体，苯甲醇为引发剂，加入少量Sn（Oct）2，控制ε-CL、苯甲醇以及Sn（Oct）2的质量比为50：5～10：0.5～1，在N2环境中80～120℃条件下不断搅拌，持续反应12～48h，获得聚己内酯（PCL-OH）；（2）将0.8～1.6gPCL-OH加入到10mLDCM溶液中，另将0.8～1.6g对硝基苯基氯甲酸酯（NPC）溶于10mLDCM，将两溶液混合，室温下反应12～48小时生成PCL-NPC；（3）将0.5～1g胱氨和1～4mL三乙胺溶于20mL甲醇中，10～30min之后，将10mL二碳酸二叔丁基甲酯（Boc2O）（0.4～0.8g）甲醇溶液缓慢滴加到上述溶液中，N2环境室温条件下反应6～12小时生成Cys-Boc-Mono；（4）将0.4～0.8gPCL-NPC、0.2～0.4gCys-Boc-Mono和0.4～0.8mL三乙胺溶于二氯甲烷中，N2环境室温条件下反应12～48小时生成PCL-Cys-Boc-Mono，去保护后生成PCL-Cys-NH2；（5）将0.4～0.8gPCL-Cys-NH2和0.4～0.8g壳聚糖（CTS）分散到30～50ml四氢呋喃中，N2环境室温条件下反应12～24小时，后加入0.1～0.5甘草次酸（GA）、0.1～0.5gEDC·HCl和0.1～0.5gNHS，N2环境室温条件下，继续反应12～24小时，反应结束后用乙醇清洗数遍，离心获得还原环境敏感的PCL-SS-CTS-GA聚合物。b、载CPT磷酸钙纳米颗粒制备：（1）取10mgCPT和20～40mg的氯化钙溶于1mL蒸馏水中混合均匀；（2）取80～120mg的磷酸氢二钠溶于1mL蒸馏水中混合均匀；（3）取环己烷、己醇、Trion-X100于烧杯中充分搅拌，其体积比为3：1～3：3～5；（4）分别取10mL（3）中的混合液放入小烧杯中标记为A和B，在A中加入80～120μL上述氯化钙和CPT混合液，在B中加入80～120μL上述磷酸氢二钠溶液；将B溶液缓慢滴加到A中，反应2～4h，加入10～20mL乙醇破乳，用蒸馏水清洗数遍。c、组装一层样品制备：取0.1gPCL-SS-CTS-GA聚合物溶于10～20mL、0.2%（v/v）、pH为6.0的醋酸缓冲液，不断搅拌，滴加1～2mL载CPT磷酸钙纳米颗粒分散液（0.1g/mL），持续搅拌20～40min，用醋酸缓冲液洗涤，离心获得组装一层样品。d、组装两层样品制备：取2gι-卡拉胶加入到含有10～20mL、0.5～3%（v/v）醋酸溶液的三口瓶中，在60～80℃下搅拌至ι-卡拉胶完全溶解。不断搅拌，滴加1～2mL组装一层样品分散液（0.1g/mL），持续搅拌20～40min，用醋酸缓冲液洗涤，离心获得组装两层样品。e、利用c或d方法交替组装壳聚糖衍生物与ι-卡拉胶得到多层的样品。在上述制备过程中，磷酸钙纳米模板的去除过程是伴随着两层样品制备而进行的，0.5～3%（v/v）醋酸溶液能够溶解磷酸钙纳米核心，而生成包含HCPT的囊腔结构。在上述制备过程中，最终产品的外层是具有还原性响应的壳聚糖衍生物。本专利技术制备的纳米载药系统可用于靶向运输HCPT到肝癌细胞。相比于现有技术，本专利技术具有如下优点:1、由于最外层壳聚糖衍生物甘草次酸配体的引入，该靶向纳米囊系统具有很好的肝癌细胞靶向性。2、该载体具有还原性响应，受到癌细胞较强还原性环境刺激能够快速释放负载的羟基喜树碱。3、具有很高的生物相容性，不会引发严重的副作用。4、以天然多糖作为囊壁材料，具有较强的生物可降解性。5、该刺激响应型纳米载体系统有望实现：（1）可以主动靶向定位肝癌细胞并能通过受体介导内吞过程进入细胞；（2）通过高通透长滞留效应（PermeationandRetentioneffect，EPR）渗出并定位与肿瘤组织间隙，然后在弱酸性肿瘤微环境中，通过表面电荷的可转变性，促进入胞；（3）进入细胞后，由于肿瘤细胞的弱酸性和高还原性环境的刺激，实现对装载药物的控制性释放。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖在本专利技术的保护范围中。实施例1制备含有3层囊壁层层自组装靶向纳米微囊：a、还原敏感性壳聚糖衍生物制备：取50gε-己内酯（ε-CL）为单体，10g苯甲醇为引发剂，加入1gSn（Oct）2，在N2环境中80℃条件下不断搅拌，持续反应12h，获得聚己内酯（PCL-OH）。将0.8gPCL-OH加入到10mLDCM溶液中，另将0.8g对硝基苯基氯甲酸酯（NPC）溶于10mLDCM，将两溶液混合，室温下反应24小时生成PCL-NPC。将0.5g胱氨和2mL三乙胺溶于20mL甲醇中，10min之后，将10mL二碳酸二叔丁基甲酯（Boc2O）（0.4g）甲醇溶液缓慢滴加到上述溶液中，N2环境室温条件下反应6小时生成Cys-Boc-Mono。将0.4gPCL-NPC、0.2gCys-Boc-Mono和0.4mL三乙胺溶于二氯甲烷中，N2环境室温条件下反应12小时生成PCL-Cys-Boc本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种包含喜树碱的层层自组装纳米靶向载体的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：a、还原敏感性壳聚糖衍生物制备：（1）以ε‑CL为单体，苯甲醇为引发剂，加入Sn（Oct）2，控制ε‑CL、苯甲醇以及Sn（Oct）2的质量比为50：5～10：0.5～1，在N2环境中80～120℃条件下不断搅拌，持续反应12～48 h，获得PCL‑OH；（2）将0.8～1.6 g PCL‑OH 加入到10 mL DCM溶液中，另将0.8～1.6 g NPC溶于10 mL DCM，将两溶液混合，室温下反应12～48小时生成PCL‑NPC；（3）将0.5～1 g胱氨和1～4 mL三乙胺溶于20 mL甲醇中，10～30 min之后，将10 mL Boc2O甲醇溶液缓慢滴加到上述溶液中，N2环境室温条件下反应6～12小时生成Cys‑Boc‑Mono；（4）将0.4～0.8 g PCL‑NPC、0.2～0.4 g Cys‑Boc‑Mono和0.4～0.8 mL三乙胺溶于二氯甲烷中，N2环境室温条件下反应12～48小时生成PCL‑Cys‑Boc‑Mono，去保护后生成PCL‑Cys‑NH2；（5）将0.4～0.8 g PCL‑Cys‑NH2和0.4～0.8 g CTS分散到30～50 ml 四氢呋喃中，N2环境室温条件下反应12～24小时后加入0.1～0.5 GA、0.1～0.5 g EDC·HCl 和0.1～0.5 g NHS，N2环境室温条件下，继续反应12～24小时，反应结束后，用乙醇清洗数遍，离心获得还原环境敏感的PCL‑SS‑CTS‑GA聚合物；b、载CPT磷酸钙纳米颗粒制备：（1）取10 mg CPT和20～40 mg的氯化钙溶于1 mL蒸馏水中混合均匀；（2）取80～120 mg的磷酸氢二钠溶于1 mL蒸馏水中混合均匀；（3）取环己烷、己醇、Trion‑X100于烧杯中充分搅拌，其体积比为3：1～3：3～5；（4）分别取10 mL（3）中的混合液放入小烧杯中标记为A和B，在A中加入80～120 μL上述氯化钙和CPT混合液，在B中加入80～120 μL上述磷酸氢二钠溶液；将B溶液缓慢滴加到A中，反应2～4 h，加入10～20 mL乙醇破乳，用蒸馏水清洗；c、组装一层样品制备：取0.1 g PCL‑SS‑CTS‑GA聚合物溶于10～20 mL 醋酸缓冲液，不断搅拌，滴加1～2 mL 载CPT磷酸钙纳米颗粒分散液，持续搅拌20～40 min，用醋酸缓冲液洗涤，离心获得组装一层样品；d、组装两层样品制备：取2 g ι‑卡拉胶加入到含有10～20 mL 醋酸溶液的三口瓶中，在60～80℃下搅拌至ι‑卡拉胶完全溶解；不断搅拌，滴加1～2 mL组装一层样品分散液，持续搅拌20～40 min，用醋酸缓冲液洗涤，离心获得组装两层样品；e、利用c或d方法交替组装壳聚糖衍生物与ι‑卡拉胶，得到多层纳米靶向载体。...
【技术特征摘要】
1.一种包含喜树碱的层层自组装纳米靶向载体的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：a、还原敏感性壳聚糖衍生物制备：（1）以ε-己内酯为单体，苯甲醇为引发剂，加入Sn（Oct）2，控制ε-己内酯、苯甲醇以及Sn（Oct）2的质量比为50：5～10：0.5～1，在N2环境中80～120℃条件下不断搅拌，持续反应12～48h，获得PCL-OH；（2）将0.8～1.6gPCL-OH加入到10mL二氯甲烷溶液中，另将0.8～1.6g对硝基苯基氯甲酸酯溶于10mL二氯甲烷，将两溶液混合，室温下反应12～48小时生成PCL-NPC；（3）将0.5～1g胱氨和1～4mL三乙胺溶于20mL甲醇中，10～30min之后，将10mLBoc2O甲醇溶液缓慢滴加到上述溶液中，N2环境室温条件下反应6～12小时生成Cys-Boc-Mono；（4）将0.4～0.8gPCL-NPC、0.2～0.4gCys-Boc-Mono和0.4～0.8mL三乙胺溶于二氯甲烷中，N2环境室温条件下反应12～48小时生成PCL-Cys-Boc-Mono，去保护后生成PCL-Cys-NH2；（5）将0.4～0.8gPCL-Cys-NH2和0.4～0.8g壳聚糖分散到30～50ml四氢呋喃中，N2环境室温条件下反应12～24小时后加入0.1～0.5甘草次酸、0.1～0.5gEDC·HCl和0.1～0.5gNHS，N2环境室温条件下，继续反应12～24小时，反应结束后，用乙醇清洗数遍，离心获得还原环境敏感的PCL-SS-壳聚糖-甘草次酸聚合物；b、载喜树碱磷酸钙纳米颗粒制备：（1）取10mg喜树碱和20～40mg的氯化钙溶于1mL蒸馏水中混合均匀；（2）取80～120mg的磷酸氢二钠溶于1mL蒸馏水中混合均匀；（3）取环己烷、己醇、Trion-X100于烧杯中充分搅拌，其体积比为3：1～3：3～5；（4）分别取10mL（3）中的混合液放入小烧杯中标记为A和B，在A中加入80～120μL上述氯化...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺金梅，颜廷胜，程凤，刘长瑜，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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