本发明专利技术公开了一种联用三种抗HLA-G、EpCAM和CK8/18的单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中的应用。本发明专利技术还提供一种乳腺癌肿瘤细胞的分选方法，其制备三种偶联抗体的免疫磁珠联合应用对乳腺癌肿瘤细胞富集率较高，敏感性及可重复性均较好，均可以检出相关的肿瘤细胞。本发明专利技术联用三种免疫磁珠(EpCAM，HLA-G，CK8/18)进行肿瘤细胞富集，最大程度上扩大了循环肿瘤细胞的覆盖率，富集率达到80%，此技术是国际首创。特别是抗HLA-G的单克隆抗体磁珠的使用，保证了肿瘤细胞富集的特异性和敏感性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种分选肿瘤细胞的方法，特别是涉及一种以应用抗HLA-G抗体为核心的,三种抗HLA-G、EpCAM、CK8/18抗体偶联磁珠,联用三种偶联抗体的免疫磁珠分选乳肿瘤细胞的方法。
技术介绍
循环肿瘤细胞在外周血中的数量极少,通常在约1亿个白细胞和500亿个红细胞中仅有数个肿瘤细胞，大约每105～107个单核细胞中才有一个循环肿瘤细胞。因此，为了提高循环肿瘤细胞的检出率,通常需在检测前行循环肿瘤细胞的富集。细胞富集可通过肿瘤细胞的特异性标志物（免疫分离）或细胞形态特征如细胞体积和密度等来实现。常用的细胞富集技术主要有免疫磁分选、密度梯度离心和细胞过滤等。1.1密度梯度离心法：是一种基于物理学特性、利用在一定离心力下细胞之间沉降率不同分离细胞的技术。这是实验室一项常用的技术，用于分离单核细胞等。利用这项技术建立的Onclquick(GreinerBio-One,Frickenhausen，Germany)和Ficoll-Hypaque分离法，利用专用的多孔屏障和密度梯度分离液，在一定离心力下分离出肿瘤细胞。这项技术设备简单操作简便，能得到细胞的完整形态，便于进一步鉴别，在部分临床研究中显示出一定的临床意义，但是敏感性和特异性均不高，胖瘤细胞回收率低，限制了其临床应用。1.2膜过滤法：是利用肿瘤细胞直径与血液细胞的区别，通过一定孔径的膜来过滤细胞而达到分离细胞的目的。同密度梯度离心法不一样，这项技术是利用细胞的形态学特点来富集肿瘤细胞的技术。一般血细胞直径在8-llum之间，而肿瘤细胞相对直径较大（例如乳腺癌细胞直径约30um)，借此区别以分离肿瘤细胞和正常血液细胞。肿瘤细胞与部分血液细胞的差别并没有那么明显，是该技术被人话病的方面，但是它的优势同样明显：更多类型的肿瘤都适合利用大小来区分正常血液细胞而不因表面标志缺失或者肿瘤异质性导致的漏检。第一个采用此法的是ISET(IsolationbySizeofEpithilialTumorcells),该方法设备简单，操作方便，而且细胞表面标记能完整保留；聚集的在一起的肿瘤细胞更容易分离，利于后续的进一步检测。但是，循环中的肿瘤细胞孔径不是均一的，在免疫系统攻击及血液剪切力的作用下往往发生变形，因此膜孔径的大小设定是个难题。有研究认为Sum的孔径分离效果好，但是敏感性受到质疑。在此基础上新发展的ScreenCell分离法，得到的胖瘤细胞除可常规检测外还可用于细胞培养，且有较好的敏感性。鉴于依照肿瘤细胞大小的分离方法的优势，目前依据细胞大小分离肿瘤细胞的微过滤技术研发成功，初期的实验结果显示其比抗原抗体结合分离法有更高的灵敏性，更方便进行分子检测，下面为相关的专门描述。以细胞大小为基础的微芯片过滤：以肿瘤细胞大小为基础建立的富集平台逐渐有了更多的报道，这种方法得到的肿瘤细胞有利于进行下一步的基因和分子的分析。其中一种采用高密度微孔工艺技术大大提高了该方法对循环肿瘤细胞的富集率，以培养细胞加入外周血进行实验发现其对肿瘤细胞的回收率超过90%，并且7.5mL血液标本的分离只需要不到3分钟的时间就能完成。与CellSearch系统比较，在57例转移性前列腺癌、大肠癌、乳腺癌和膀胱癌患者中，该芯片在51例患者中发现肿瘤细胞，而CellSearch系统只在其中26例患者血液标本中为阳性结果，并且芯片回收的循环肿瘤细胞数量是CellSearch系统的5.5倍。有一篇报道_比较了依照大小富集和CellSearch系统富集循环肿瘤细胞效率的实验，结果也是类似的，这些都显示出CellSearch系统的局限性。以大小为基础的微芯片分离技术的富集效率取决于微孔的密度和规律，尽管显示出一定的优势，目前仍没有应该该方法的临床大宗报道。1.3抗原抗体结合分离法：以抗原抗体结合为基础的循环肿瘤细胞分离方法是目前最常用的方法。利用肿瘤细胞和正常血液细胞表达的不同表面抗原标记，设计不同的抗体与之结合，利用抗原抗体结合的高度特异性和灵敏性，达到区别和富集循环肿瘤细胞的目的（多是将抗体和磁珠结合，在磁场中达到分离的目的）。免疫磁珠法富集法的有效性要比传统方法高很多。和众多富集技术相比，此技术较为成熟，细胞回收率高，文献报道肿瘤细胞回收率约为85%左右。基于磁珠的富集方法从原理上分为两种为免疫阳性富集和阴性富集两种方式。1.3.1免疫磁珠阳性扑获：EpCAM(上皮细胞枯附因子）是最常用的免疫磁珠阳性扑获的目标抗原。EpCAM是上皮来源肿瘤最常见的表面标记，EpCAM抗体结合磁珠，与肿瘤细胞表面抗原结合，在磁场中得到分离。但是，基于此原理的分离技术需要肿瘤细胞表面有稳定、丰富的表面标记，否则就容易产生假阴性的结果。据研究，由于转移过程中的上皮间质转化(EMT)、肿瘤细胞的异质性等原因，一些肿瘤细胞表面EpCAM表达减弱或者缺失并且非上皮来源的肿瘤细胞不表达EpCAM，例如黑色素瘤细胞。为了提高该技术的敏感性，可考虑应用联合抗体磁珠来进行扑获。新发展的生物芯片技术，利用EpCAP包被的芯片微槽，可以过滤血液富集肿瘤细胞，提高富集效率约100倍。正性富集的特点具有较高的富集效率，由于CTCs属于外周血内的稀有细胞，因此能够高效率的回收肿瘤细胞是正性富集的最大优势，其富集的倍数从104到2×105不等。因此正性富集能提高鉴定cTCs的灵敏度。但正性富集仍存在方法学的不足，因其原理是将血液内具有上皮表型的细胞全部回收，富集中使用的主要抗原是EpCAM。但并非只有肿瘤细胞表达EpCAM，血液来源的某些细胞或非恶性上皮细胞表达EpCAM时也会被富集。肿瘤在转移的过程中，部分肿瘤细胞表型发生转化，上皮间皮转化(Epithelialtomesenchymaltransition，EMT)现象，上皮标记抗原EpCAM将表达下调，使磁珠的富集效率降低。此外，肿瘤细胞的特点之一就是异质性，有些CTCs不表达EpCAM，阳性选择可能会导致假阴性的结果。另外，由于肿瘤细胞分离后仍然同磁珠相连，磁珠的质量和数量将影响对其鉴定，但目前由于技术进步，磁珠的体积已降低几十倍，此种影响已不明显。1.3.2免疫磁珠阴性分选：与阳性扑获类似，阴性分选也利用的是磁珠分选原理。但是阴性分选与磁珠结合的抗体是结合正常血液细胞表面的抗原，肿瘤细胞表面不表达此类抗原，比如CD45。负性富集的原理是将血液中其它细胞全部除去，而后剩余细胞即为包含CTCs在内全部稀有细胞，再行鉴定。血液中的红细胞被裂解，白细胞结合抗体和磁珠后在磁场中滞留，剩余的是肿瘤细胞和少量的红、白细胞，然后再利用免疫焚光染色识别和计数肿瘤细胞。阴性富集的缺点是回收率不及阳性富集，优点是鉴定的CTCs没有被磁珠标记，在样本处理和富集的过程相对较少受到影响。与阳性扑获相比，阴性分选不受肿瘤细胞表面抗原变化的影响，因此在循环肿瘤细胞表面抗原表达不一致和特异性、敏感性较低的肿瘤中也可以应用，比如黑色素瘤等，且敏感性相对较高，但干扰细胞残留较多。这项技术目前未发展出自动系统，操作较为复杂，人为因素影响相对较大，不过仍然是未来可能的发展方向。1.3.3CellSearch检测系本文档来自技高网...
【技术保护点】
联用三种抗HLA‑G、EpCAM和CK8/18的单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中的应用。
【技术特征摘要】
1.联用三种抗HLA-G、EpCAM和CK8/18的单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞包括乳腺癌肿瘤细胞、食道癌症、非小细胞肺癌、子宫癌、结肠癌、胃癌等。
3.一种肿瘤细胞的分选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）抗HLA-G的单克隆抗体、抗EpCAM的单克隆抗体、抗CK8/18的单克隆抗体分别偶联免疫磁珠得抗HLA-G免疫磁珠、抗EpCAM免疫磁珠和抗CK8/18免疫磁珠；
（2）将抗HLA-G免疫磁珠，抗EpCAM免疫磁珠和抗CK8/18免疫磁珠混合后加入到待分选的细胞液中，用免疫磁珠分离方法进行分离，其中抗HLA-G免疫磁珠、抗EpCAM免疫磁珠和抗CK8/18免疫磁珠混合后的质量百分比分别为55-65%、30-40%、5-15%。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗EpCAM的单克隆抗体为EBA-1、A-20或C-10，所述抗CK8/18的单克隆抗体为CM-058、M20或A-9，所述抗HLA-G的单克隆抗体为MEM-G/2、MEM-G/9或4H84。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中抗HLA-G的单克隆抗体、EpCAM的单克隆抗体和抗CK8/18的单克隆抗体与免疫磁珠偶联均为抗体过饱合偶联。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗HLA-G的单克隆抗体和免疫磁珠之间用料质量比为300μg抗体:100μg活化磁珠；所述抗EpCAM的单...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢英，
申请(专利权)人：卢英，
类型：发明
国别省市：山东;37
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