一种联合检测sFlt-1/PLGF和HLA-G检测先兆子痫的方法技术

本发明专利技术为一种联合检测sFlt‑1/PLGF和HLA‑G预测先兆子痫的方法：血清标本采集：分别采集先兆子痫组孕妇和正常同孕周孕妇静脉血5‑10ml，所有标本均在4h内用低温离心机3000rpm离心10min，取血清分装于EP管中，‑80℃冰箱保存待测；包被：用0.05M PH9.0碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，冲洗3次；设置标准品孔和样本孔，洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；加酶标抗体；除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min；洗板；每孔加入底物A、B各50μL，测定各孔OD值。其检测特异性和灵敏度高。

A method for combined detection of sFlt-1/PLGF and HLA-G in detection of pre eclampsia

The present invention is a method for joint detection of sFlt_1/PLGF and HLA_G in predicting preeclampsia: Serum samples were collected: 5_10ml venous blood was collected from preeclampsia group and normal pregnant women of the same gestational age, all samples were centrifuged with a cryogenic centrifuge of 3000rpm for 10 minutes within 4 hours, and the serum was separated into EP tubes and stored in a refrigerator at 80 C for testing. Coating: dilute the antibody to protein content of 1-10 ug/ml with 0.05MPH 9.0 carbonate-coated buffer, add 0.1ml in each polystyrene plate reaction pore, overnight at 4 C, discard the solution in the pore the next day, rinse three times; set standard pore and sample pore, wash, and make blank pore, negative control pore and positive pair at the same time. In addition to the blank hole, the standard pore and sample pore were labeled with horseradish peroxidase antibody 100 mu L. The reaction pore was sealed with a sealing membrane and incubated for 60 min in a 37 C water bath or thermostat. The OD value of each pore was determined by washing the plate and adding substrates A and B 50 mu L to each pore. Its specificity and sensitivity are high.

【技术实现步骤摘要】
一种联合检测sFlt-1/PLGF和HLA-G检测先兆子痫的方法
本专利技术涉及免疫检测领域，具体为一种联合检测sFlt-1/PLGF和HLA-G检测先兆子痫的方法。
技术介绍
先兆子痫是高血压、水肿和蛋白尿的综合征，在全部妊娠中占7-15％，并且是其母体发病和致死的主要原因。全世界每年至少造成20万名产妇死亡。先兆子痫的症状通常是在怀孕第20周后出现且通常是通过常规监测妇女的血压和尿液而监测出来的。然而这些监测方法并不能有效的诊断早期综合征，如果能够早期监测到先兆子痫，采取有效的治疗，就可减少被试者或发育中胎儿的危险。先兆子痫的发病机制目前尚未完全清楚，其病因可能涉及母体、胎盘和胎儿等多种因素，包括血管内皮损伤和功能障碍、血管活性物质失衡及滋养细胞侵袭异常等。子宫-胎盘缺血缺氧学说是目前较为公认的子痫前期发病机制之一，其中胎盘缺血学说更为重要。先兆子痫是常见的妊娠期合并症，随着孕周的增加，该病有逐渐加重的趋势，但在胎盘娩出后，其病情便迅速得到控制和缓解，提示子痫前期是一种胎盘源性疾病。另外，某些患妊娠滋养细胞疾病的患者也会表现子痫前期的症状，更有力的证明了其发病与胎盘滋养细胞有关。上述现象均提示子痫前期的病因是胎盘因素。因而在对于子痫前期发病机制的研究中，正逐渐倾向于将其视为一种胎盘源性疾病，目前认为，血管内皮细胞的损伤、胎盘缺血缺氧及胎盘浅着床是子痫前期发病的病理生理基础，而母儿免疫失衡及遗传背景变化将使易感性增加。上述胎盘及滋养细胞缺血学说认为子痫前期的关键发病机制是绒毛外滋养细胞在孕早期对螺旋动脉侵袭不足，导致子宫螺旋动脉的重塑过程发生障碍，致使胎盘缺血缺氧，某些细胞毒性因子异常分泌，进入母体后引起广泛的血管内皮细胞损伤。子痫前期所产生的高血压、蛋白尿及水肿表现均是母体血管内皮的功能障碍所致。因此目前临床上有关子痫前期的预测研究主要围绕血管内皮功能紊乱及滋养细胞浅着床的机制而展开。先兆子痫(PE)的两个阶段发病理论被普遍认同，第一阶段称为临床前期，是由于绒毛外滋养细胞浸润能力下降，导致子宫螺旋动脉血管重铸不良、胎盘浅着床、胎盘血流灌注不足，进而导致胎盘缺血缺氧，刺激产生大量的胎盘因子；第二阶段为临床症状期，胎盘缺血缺氧进行性加重，胎盘损伤及组织细胞坏死，导致机体抗氧化能力降低，氧化和抗氧化平衡失调，出现氧化应激反应，并产生大量的氧化中间产物，其与胎盘因子通过母体血液循环，使得PE的病理变化从子宫-胎盘局部发展到全身各系统，引起血管内皮细胞损伤、凝血功能障碍、血管活性物质失衡、脂代谢障碍等各种临床症状。先兆子痫对母胎的危害相对较大，但是目前一旦发现一般都是出现了临床症状，无法采取有效的措施。虽然目前缺乏针对子痫前期的预防和治疗方法，但是寻求可以检测该危及生命的妊娠疾病的发展或者有助于该疾病的检测的非侵入性生物标志物仍然是最重要的。血清学指标检测是目前检测子痫前期的重要方法之一。寻找较高特异性、敏感性的生物指标来早期预测子痫前期的发病风险成为摆在研究人员面前的新课题。现有技术主要在检测方法和标志物选择方面存在以下缺陷：先兆子痫的发病机制目前尚未完全清楚，其病因可能涉及母体、胎盘和胎儿等多种因素，包括血管内皮损伤和功能障碍、血管活性物质失衡及滋养细胞侵袭异常等。发病涉及因素较多，发病机制比较复杂，因此目前文献中报道的标志物也是比较多，比较混杂。由于其复杂的发病机制，目前文献中常用于检测的大多是单一标志物以及两种标志物进行联合检测，三种标志物的联合检测目前还不多见，并且报道所知，选择的标志物联合检测之后敏感性和特异性方面都有待进一步提高。在标志物的选择方面也存在代表性不强，选择单一等缺点。
技术实现思路
针对现有先兆子痫检测采用的标志物及其组合的检测灵敏度和特异性不高，本专利技术选取了及具有代表性的sFlt-1/PLGF的比值和HLA-G进行联合检测，以提高检测先兆子痫的敏感性和特异性。本专利技术提供如下技术方案：一种用于检测先兆子痫标志物，该先兆子痫标志物为sFlt-1/PLGF和HLA-G。本专利技术还提供另外一种技术方案：该方法包括以下步骤：所述用于预测先兆子痫标志物的血清水平检测均采用ELISA方法中的双抗体夹心法进行检测；统计学分析：采用SPSS19.0统计软件分析，检测结果均采用均数±标准差(X±s)表示。作为优选，所述统计分析分析先兆子痫组、正常妊娠组中三种血清标志物的水平；分析先兆子痫组、正常妊娠组中sFlt-1/PLGF的比值水平；分析三种标志物单独检测和联合检测的灵敏性与特异性，以P＜0.05为差异有统计学意义。进一步地，所述ELISA双抗体夹心法进行血清水平检测的实验步骤为：(1)血清标本采集：先兆子痫组孕妇入院后，采集肘静脉血5-10ml至采血管中，正常同孕周孕妇进行产前检查时采肘静脉5-10ml于另外的采血管中；收集血液后，所有标本均在4h内用低温离心机3000rpm离心10min，取血清分装于EP管中，-80℃冰箱保存待测；(2)取出各试剂盒从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条；(3)包被：用0.05MPH9.0碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；(4)设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；(5)将待测样本在-80℃取出，平衡至室温，样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL，置37℃孵育1小时，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；(6)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤；(7)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min；(8)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次或者用洗板机洗板；(9)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；(10)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值上述联合检测先兆子痫的三种生物标志物分别是PLGF(胎盘生长因子)、sFlt-1(人可溶性FMS样酪氨酸激酶1)、HLA-G(人白细胞抗原G)。其中PLGF(胎盘生长因子)：PLGF属于血管内皮生长因子(VEGF)家族成员，丰富表达与胎盘，主要生物学功能是诱导血管内皮细胞增殖、迁移和激活，促使胎盘血管的生成，抗血管内皮细胞凋亡，促进滋养细胞的增值和侵袭，增加血管通透性，对胎盘形成和胎儿发育有着重要作用。PLGF与VEGF-A具有结构同源性，PLGF的生理作用与VEGF基本一致，PLGF由细胞滋养层及合胞体滋养层表达且能够诱导内皮细胞的增值、迁移及活化。PLGF以同型二聚体与Flt-1受体结合，但不与KDR受体结合。但PLGF可以在缺血，炎症和伤口愈合的情况下诱发血管生成。PLGF通过将VEGF从Flt-1受体上替换下来，并使其结合到KDR受体，从而达到增强VEGF信号的目的。PLGF可刺激滋养细胞DNA合成；从而促进滋养细胞增殖分化。而且PLGF能刺激内皮细胞的增值与迁本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于预测先兆子痫标志物，其特征在于，该先兆子痫标志物为sFlt‑1/PLGF和HLA‑G。

【技术特征摘要】
1.一种用于预测先兆子痫标志物，其特征在于，该先兆子痫标志物为sFlt-1/PLGF和HLA-G。2.一种联合检测sFlt-1/PLGF和HLA-G预测先兆子痫的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：所述标志物的血清水平检测均采用ELISA方法中的双抗体夹心法进行检测；统计学分析：采用SPSS19.0统计软件分析，检测结果均采用均数±标准差X±s表示。3.根据权利要求2所述的联合检测sFlt-1/PLGF和HLA-G预测先兆子痫的方法，其特征在于，所述统计分析分析先兆子痫组、正常妊娠组中三种血清标志物的水平；分析先兆子痫组、正常妊娠组中sFlt-1/PLGF的比值水平；分析三种标志物单独检测和联合检测的灵敏性与特异性，以P＜0.05为差异有统计学意义。4.根据权利要求2所述的联合检测sFlt-1/PLGF和HLA-G预测先兆子痫的方法，其特征在于，所述ELISA双抗体夹心法进行血清水平检测的实验步骤为：(1)血清标本采集：先兆子痫组孕妇入院后，采集肘静脉血5-10ml至采血管中，正常同孕周孕妇进行产前检查时采肘静脉5-10ml于另外的采血管中；收集血液后，所有标本均在4h内用低温离心机3000rpm离心10min，取血清分装于...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢英，
申请(专利权)人：卢英，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA