本发明专利技术公开了一种金枪鱼类及其深加工产品种类鉴定的荧光定量PCR检测方法，依次进行以下步骤：1)、待测金枪鱼样品中基因组DNA的提取，得DNA模板；2)、对以下11种常见金枪鱼进行特异性鉴定引物与探针的设计；11种常见金枪鱼为：长鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、大眼金枪鱼、蓝鳍金枪鱼、鲣属的正鲣、青干金枪鱼、扁舵鲣、圆舵鲣、东方狐鲣、鲔以及条纹四鳍旗鱼；3)、荧光定量PCR体系的配置；以基因组DNA为扩增模板，使用上述特异性鉴定引物和探针，进行实时荧光PCR检测；4)、根据实时荧光PCR检测结果进行判断(即，对市售金枪鱼样品的种类鉴定，判断是否与标签所述相符)。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种适用于金枪鱼类及其深加工产品种类鉴定的荧光定量PCR检测 方法。
技术介绍
金枪鱼类（Tuna)，又叫鲔鱼、吞拿鱼，是硬骨鱼纲（Osteichthyes)、鱼卢形目 (Pereiformes)、鲭科（Scombridae)鱼类中具有胸甲（指胸区和侧线前部明显扩大的鳞片） 的几个属鱼类的总称。金枪鱼类身体呈纺锤型、粗壮，适于快速游泳。它们广泛分布于太平 洋、大西洋和印度洋的温带和热带水域，栖息于水深100~500m的大洋深处，属大洋暖水性 高度洄游鱼类。常见的金枪鱼类有5个属17个种，其中经济价值较大的有6种，分别是金 枪鱼属的长鳍金枪鱼（Thunnus alalunga)、黄鳍金枪鱼（Thunnus albacares)、大眼金枪鱼 (Thunnus obesus)、金枪鱼（Thunnus thynnus)、蓝鳍金枪鱼（Thunnus maccoyii)和麵属的 正麵（Katsuwonus pelamis) 〇 金枪鱼属于红肉鱼类，肉质柔嫩、鲜美，蛋白质含量很高，氨基酸配比优越；富含 DHA、EPA等具有生物活性的多不饱和脂肪酸，可促进大脑发育、有效预防心脑血管疾病；同 时，蛋氨酸、牛磺酸、矿物质和维生素含量丰富，具有高蛋白、低热量和低脂肪的特点，是国 际营养协会推荐的绿色无污染健康美食。金枪鱼的消费形式主要有罐头制品和生鱼片。生 鱼片市场所要求的金枪鱼规格比较大，以蓝鳍金枪鱼、大眼金枪鱼和黄鳍金枪鱼为主，其中 黄鳍金枪鱼是上等的生鱼片原料。长鳍金枪鱼和鲣鱼通常用来制作金枪鱼罐头。日本、西欧 和美国是金枪鱼的主要消费市场。日本多以生鱼片的方式食用，一般年消费量80-90万吨， 约占整个世界金枪鱼消费总量的30%左右。欧洲和美国则以金枪鱼罐头消费为主，品种包 括水渍金枪鱼罐头、色拉金枪鱼罐头、油渍金枪鱼罐头等。由于我国远洋金枪鱼渔业起步较 晚，国内市场上金枪鱼长期被视为高级食品。由于具有较高的营养价值，近年来国际上金枪 鱼类产品的消费量逐渐上升，但其远洋捕捞资源已日渐枯竭。除6种经济价值比较高的优 质金枪鱼外，另外一些相似的品种如鲔（Euthynnus affinis),扁舵鲣（Auxis thazard)，东 方狐鲣（Sarda orientalis)也常常用于生产金枪鱼罐头、鱼酥等产品。以不同原鱼料所生 产的金枪鱼产品营养价值有很大区别，价格也千差万别；并且其有毒、过敏物质如组胺、汞 的含量也各不相同，对婴幼儿或过敏体质的人可能会引发食物中毒事件。虽然很多国家都 有相应的法规，规定在金枪鱼产品的标签中明确其种类和来源。然而，掺假造假的判定和标 签制度的有效实施，必须是建立在快速、准确的金枪鱼品种鉴定的基础上的，但目前该领域 国内的研宄还是空白。因此，为了杜绝某些不法商贩以次充好的欺诈行为、维护消费者的知 情权，迫切需要建立灵敏、可靠的检测方法和检测体系来鉴定金枪鱼类产品原鱼料的品种。 目前，已报道的金枪鱼种类鉴定的方法有传统形态学法、蛋白质电泳法和DNA分 子遗传标记方法。形态学方法依赖于专业人士的长期工作经验，对亲缘关系相近的相似种 的判断并非有效。而且对于市面上常见的加工过金枪鱼产品（生鱼片、罐头类），可供种类 鉴别的形态学特征几乎不存在；蛋白质分析方法不适用于深加工产品，因为产品加工过程 中的热处理使蛋白质的生化特性及其结构完整性都被破坏；而基于DNA技术的分子生物学 方法，就显示出明显优势。DDNA比蛋白质耐热性强。尽管DNA在加工过程中也会被降解， 但是仍然能提取出小片段的DNA。2)作为生物体的遗传物质，DNA分子能够提供更多信息。 3)DNA分子稳定，不受组织类型、年龄及生理状态等因素的影响。 DNA分子技术用于种类鉴定有多种常见方法，如限制性片段长度多态性（RFLP) 标记、单碱基多态性（SNP)标记、微卫星（microsatellite)标记、DNA条形码技术（DNA barcode)、荧光定量PCR技术等。 RFLP首先需要对目标DNA片段进行PCR扩增，然后选择合适的限制性内切酶切 割扩增片段，通过琼脂糖凝胶电泳获得不同物种的限制性酶切片段图谱。该方法花费低， 操作简单，但也存在诸多缺点：1)由于存在种内变异以及不同密码子的简并性特征，同一 物种不同个体可能存在不同的限制片段酶切图谱；2)除生鱼片外，金枪鱼深产品（如金枪 鱼罐头）在加工过程中通常使用长时间（>15min)高温（>115°C )处理，DNA分子常降解为 100-200bp的小片段，这可能严重影响酶切片段的多态性的判断。 SNP和microsatellite标记常用于金枪鱼同种鱼类的群体分析。DNA barcode 是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析从而进行快速物种鉴定的技术，由Hebert 等（2003)首先提出。2003年，海洋生物普查研宄首次将DNA Barcode技术用于标本编码。 2004 年，生命条形码联盟（the Consortium for the Barcode of Life, CB0L)成立，支持 生物DNA条形码研宄的发展。至今，该组织下的鱼类DNA条码（Fish Barcode of Life campaign, FISH-B0L)已经获得了 10267个种的DNA条形码记录，包含97%的鱼类品种。该 方法在新物种的发掘和物种系统进化分析方面非常高效，但其缺点是混合样品中通常有多 种成分被同时扩增，会造成测序结果的杂乱，因此不适用于混合样品的鉴定。 荧光定量PCR技术是近年来发展起来的新的核酸定量检测方法，它在常规的PCR 基础上加入荧光信号物质（探针或染料），利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后 通过扩增曲线的Ct值（荧光信号强度达到基础信号（Base Line)时的循环数，表明PCR开 始进入指数扩增期）对未知模板进行定量分析。它集中了核酸杂交特异性强和PCR扩增灵 敏度高的优点，检测范围广（多7个数量级）、检测极限低（lc/r)，可同时对多个样品进行 快速准确分析，被认为是目前最可靠的核酸定量检测技术。在我国进出口食品的检验检疫 方面，已广泛应用于病原体检测、有害生物风险分析以及转基因产品的监管等多个方面。 近年来新发展的双重荧光定量PCR技术，即在一个反应体系中含两对引物和不同 荧光基团标记的探针，通过实时荧光反应可同时检测两种目标基因，建立快捷准确的双重 荧光定量PCR方法进行种类鉴定。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种荧光定量PCR技术，利用该技术灵敏准确的 特性，分别检测金枪鱼属的保守基因和11种金枪鱼（长鳍金枪鱼（Thunnus alalunga)、 黄鳍金枪鱼（Thunnus albacares)、大眼金枪鱼（Thunnus obesus)、蓝鳍金枪鱼（Thunnus maccoyii)、鲣属的正鲣（Katsuwonus pelamis)、青干金枪鱼（Thunnus tonggol)、扁舵鲣 (Auxis thazard)、圆航麵（Auxis rochei)、东方狐麵（Sarda orientalis)、鲔（Euthynnus affinis)以及条纹四鳍旗鱼（Tetrapturus 本文档来自技高网...
【技术保护点】
金枪鱼类及其深加工产品种类鉴定的荧光定量PCR检测方法中所用的特异性引物和探针，其特征是：所述特异性引物和探针的序列至少为以下任意一种：
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冯俊丽，戴志远，刘莎莎，叶剑，孟璐，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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