【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种具有淋巴靶向特性的重组致敏蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
1、近年来，全球食物过敏患病率持续增长。食物过敏（food allergy，fa）是机体对特定抗原产生的不良反应，通常对健康人群是无害的，由免疫机制介导，发生在对特定过敏原敏感的人身上。致敏个体摄入致敏食物可导致胃肠道（疼痛、恶心、呕吐和腹泻）、皮肤（瘙痒、荨麻疹和血管水肿）、呼吸系统和心血管系统（呼吸困难、喘息和心动过速）等一系列症状。甲壳类致敏原是八大食物致敏原之一，能引起严重的过敏反应。据统计，全球约有650万人受到食物过敏带来的困扰，其中约有10.3 %的患者对甲壳类过敏。甲壳类水产品过敏的临床症状与其他食物过敏相似，过敏症状通常在接触致敏原后立即或两小时内出现，而与小麦、鸡蛋、牛奶等致敏原不同的是甲壳类食物引起的过敏通常会伴随终生。
2、目前，针对食物过敏还缺少行之有效的治疗方法，避免致敏原的直接摄入和提供紧急治疗药物（抗组胺药、白三烯受体拮抗剂等）仍是预防食物过敏的有效方式。紧急治疗药物能暂时缓解过敏症状，但是治标不治本，会导致人体对药物产生耐受性，同时会因中枢抑制作用而引起一系列不良反应。到目前为止，过敏原特异性免疫疗法（allergen-specific immunotherapy，ait）是唯一一种可能改变疾病自然进程的治疗措施。
3、ait通过多次低剂量致敏原刺激机体，诱导免疫系统产生保护性免疫反应，降低机体对致敏原的反应阈值，从而实现脱敏治疗。ait包括舌下免疫治疗（slit）、口服免疫治疗
4、在现有技术中，针对水产品致敏原—原肌球蛋白（tropomyosin，tm）的免疫治疗问题，申请号为cn201710255941.3的专利提供了一种用于缓解对虾原肌球蛋白致敏反应的改良蛋白mmet e 1及其制备方法和应用，其通过对照新对虾属原肌球蛋白met e 1抗原特异性表位氨基酸序列与四种海洋鱼类原肌球蛋白序列，进行氨基酸序列分析，重新设计其抗原表位氨基酸残基序列得到改良蛋白mmet e 1氨基酸序列，然后转录表达得到改良蛋白mmete 1，经试验证明该改良蛋白mmet e 1能够有效地缓解对虾原肌球蛋白引起的食品过敏反应，然而该改良蛋白mmet e 1仍属于传统的重组蛋白，由于不具有靶向特性存在需要治疗周期长、抗原的给药剂量较多等问题。
技术实现思路
1、本专利技术是为了克服现有技术ait中存在的问题和不足，提供一种新型的具有淋巴靶向特性的重组致敏蛋白，并将其用作脱敏治疗虾过敏的蛋白质药物，以克服现有技术中存在的脱敏治疗周期长，需要在淋巴内进行药物注射等问题。
2、为实现上述专利技术目的，本专利技术通过以下技术方案实现：
3、本专利技术的第一个目的在于，提供了一种具有淋巴靶向特性的重组致敏蛋白，包括重组蛋白tm片段和与重组蛋白tm片段偶联且重复出现的氨基酸ek序列，其表达式为tm-(ek)n；
4、其中重组蛋白tm的氨基酸序列如seq id no.1所示；
5、所述ek序列中的e为阴离子谷氨酸，k为阳离子赖氨酸。
6、传统的食物过敏免疫耐受治疗依赖于在皮下多频次、长周期注射变应原或过敏原（主要功能成分为蛋白质），存在治疗周期长、患者依从性差、副作用大等突出问题。如何提升治疗的疗效成为亟待解决的一个问题。研究发现，淋巴内免疫耐受治疗较传统皮下治疗方式具有更好的疗效，但淋巴内注射药物操作复杂，难度大，对专业人员依赖度高。如何实现简单便捷的淋巴靶向具有重要意义；现阶段，蛋白质药物的淋巴靶向手段较为匮乏。已有报道（如江邵毅团队的先前研究）通过将聚合物（聚羧酸甜菜碱）接枝到蛋白质药物上而实现其淋巴靶向功能，但是聚羧酸甜菜碱（pcb）这类化合物需要化学工艺合成，存在合成复杂繁琐，难以产量化等困难。
7、e和k属于天然存在的氨基酸类物质，e是阴离子谷氨酸，k是阳离子赖氨酸，目前还未有研究显示e和k具有靶向特性，但在我们的研究过程中发现，e和k互相连接形成的ek序列具有与聚羧酸甜菜碱（pcb）相似的高亲水性和两性离子性质，且ek序列可以通过重组表达的方式获得，可操作性强。根据重组表达蛋白技术可用于实现蛋白质药物的个性化设计和大规模量产，由此我们设计，在原肌球蛋白（tm）上接枝由e和k重复交替出现的多肽序列，通过重组表达形成新型蛋白——重组致敏蛋白tm-(ek)n，希望具有同样性质的两性离子肽ek序列也能具有淋巴靶向特性，从而实现重组致敏蛋白tm-(ek)n具有淋巴靶向特性，成为用于虾过敏的脱敏治疗的靶向蛋白药物。由于重组蛋白tm是将从ncbi上获取南美白对虾原肌球蛋白（tropomyosin, tm）的基因序列，通过双酶切法将目的基因导入pet-28b(+)质粒得到重组质粒，并通过转入至宿主细胞，进行培养与诱导表达后所得到的蛋白，因此我们设计的在原肌球蛋白（tm）上接枝由e和k重复交替出现的多肽序列，在通过重组表达后得到的重组致敏蛋白质相当于在重组蛋白tm片段上偶联ek序列。此外，采用非化合物共价接枝（即重组蛋白表达技术）的制备方式可以使得这种重组致敏蛋白tm-(ek)n的大规模量产成为可能。
8、作为优选，所述重复出现的氨基酸ek序列的重复度n为10~50。
9、作为优选，所述重组致敏蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
10、本专利技术中的重组致敏蛋白包括重组蛋白tm片段和重复出现的氨基酸ek序列，其中在本专利技术中，以由30对阴离子谷氨酸（e）和阳离子赖氨酸（k）交替组合而成的多肽序列接枝连接于重组蛋白tm上所形成的tm-(ek)30为例，进行了重组致敏蛋白tm-(ek)30的制备，以及该蛋白在靶向脱敏治疗效果方面的检验，结合现有的研究经验，我们推测ek序列的重复度n为10~50时，重组致敏蛋白tm-(ek)n也可以具有同样的淋巴靶向特性。
11、本专利技术的第二个目的在于，提供了一种用于制备所述重组致敏蛋白的方法，包括如下步骤：
12、（1）dna序列的合成：获取原肌球蛋白的基因序列，在原肌球蛋白的dna序列的c末端连接ek多肽的dna序列；
13、（2）载体构建：将所合成的dna序列与载体质粒通过限制性内切酶处理并结合，获得重组致敏蛋白的重组质粒载体；
14、（3）转化培养：将所得重组质粒载体导入宿主细胞，培养经转化的宿主细胞，诱导使其表达重组致敏蛋白；
15、（4）蛋白纯化：超声破碎细胞，离心分离后纯化。
16、本专利技术首先从ncbi上获取南美本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有淋巴靶向特性的重组致敏蛋白，其特征在于，包括重组蛋白TM片段和与重组蛋白TM片段偶联且重复出现的氨基酸EK序列，其表达式为TM-(EK)n；
2.如权利要求1所述的一种具有淋巴靶向特性的重组致敏蛋白，其特征在于，所述重复出现的氨基酸EK序列的重复度n为10~50。
3.如权利要求1或2所述的一种具有淋巴靶向特性的重组致敏蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种用于制备如权利要求1~3中任意一项所述的重组致敏蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.如权利要求4所述的一种重组致敏蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的限制性内切酶为NdeI-XhoI，载体质粒为pET-28b(+)。
6.如权利要求4或5所述的一种重组致敏蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中的宿主细胞为BL21(DE3)。
7.如权利要求6所述的一种重组致敏蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）的诱导表达过程中，IPTG终浓度为0.1~1mM，16~37℃过夜培养。
8.
9.如权利要求8所述的重组致敏蛋白在药物中的应用，其特征在于，所述重组致敏蛋白在靶向脱敏治疗食物过敏的蛋白药物中的应用。
10.如权利要求8或9所述的重组致敏蛋白在药物中的应用，其特征在于，所述重组致敏蛋白在靶向淋巴组织治疗虾过敏的蛋白药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种具有淋巴靶向特性的重组致敏蛋白，其特征在于，包括重组蛋白tm片段和与重组蛋白tm片段偶联且重复出现的氨基酸ek序列，其表达式为tm-(ek)n；
2.如权利要求1所述的一种具有淋巴靶向特性的重组致敏蛋白，其特征在于，所述重复出现的氨基酸ek序列的重复度n为10~50。
3.如权利要求1或2所述的一种具有淋巴靶向特性的重组致敏蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
4.一种用于制备如权利要求1~3中任意一项所述的重组致敏蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.如权利要求4所述的一种重组致敏蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的限制性内切酶为ndei-xhoi，载体质粒为pet-28b(+)。
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